[發明專利]高特異性檢測NDM-1基因的引物組合物及其應用

無效

• 申請號: 201110108513.0
• 申請日: 2011-04-28
• 公開（公告）號: CN102181558A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 朱寶利;武娜;張苑怡;王志云
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/55;C12N9/80
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種高特異性檢測NDM-1基因的引物組合物及其應用。

背景技術

早在人類誕生之前，細菌便開啟了自己的生命歷程，二戰期間細菌嚴重威脅了人類的生命。1929年，弗萊明偶然間發現了青霉素(Penicillin)，隨著抗生素藥物的問世，細菌的耐藥性在一些國家得到一定的控制。1961年，后英國學者Jevons首次發現了耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resitant?Staphylococcus?aureus，MRSA)，MRSA能分泌一種酚可溶性調控蛋白(Phenol-soluble?modulin，PSM)破壞人類的嗜中性粒細胞，形成嚴重感染——第一任“超級細菌”就此誕生。近年來抗生素濫用及抗生素累積的雙重因素，使得細菌中的耐藥基因不斷積累，從而產生了多重抗藥性。

據2010年8月11日出版的英國《The?Lancet?Infectious?Diseases》期刊報道，目前有一種新的耐藥基因在一些國家流行，一些西方醫學家稱其為NDM-1基因。NDM-1基因編碼的蛋白被命名為“新德里金屬-β-內酰胺酶1(New?Metallo-β-Lactamase-1)。新德里金屬-β-內酰胺酶1由269個氨基酸殘基組成，與現有的其它金屬-β-內酰胺酶(Metallo-β-Lactamase)的一致性不足33％，且在酶活性位點附近經常有其獨特的氨基酸殘基及插入序列，并能與碳青霉烯類抗生素緊密結合。NDM-1基因目前已發現于克雷伯式桿菌的180kb的質粒和大腸桿菌的140kb的質粒上。在NDM-1基因上游的2個區域中還存在能夠抵抗鏈霉素、紅霉素、氯霉素、利福平等抗生素的基因以及消毒劑和磺胺藥物的多種耐藥基因。由于含有NDM-1基因的質粒即能在菌株之間穿梭傳遞，又可以在轉移中發生重組，且通過攜帶NDM-1基因的質粒的傳遞，還可使對抗生素敏感的細菌獲得多重耐藥性，大大增加臨床抗生素使用的困難。

目前，攜帶有NDM-1基因的超級細菌正在全球蔓延，印度、美國、英國、澳大利亞、加拿大、法國、荷蘭等多個國家已經出現了疑似病例。面對“超級細菌”的跨國傳播趨勢，尋找一種簡便、快速、準確的耐藥基因檢測方法成為許多科研工作者的重大課題，也是臨床實踐檢驗中急切解決的問題。建立快速、簡便、可靠的檢測方法對NDM-1基因進行檢測，對于指導臨床的早期治療和有效的控制超級細菌的傳播具有重大意義。

LAMP(Loop-Mediated?Isothermal?Amplification)法是2000年由Notomi等發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上六個區域的四條引物(兩條外引物，兩條內引物)及具有鏈置換活性的Bst?DNA聚合酶，在65℃左右進行核酸的指數級擴增，其擴增效率可達到10⁹-10¹⁰個拷貝數量級。整個反應僅需1小時，在擴增反應中副產物焦磷酸鎂沉淀與鈣黃綠素結合，產生黃綠色熒光，不需要借助其他儀器便可辨別實驗結果。LAMP技術具有簡便、快速、準確、廉價、易檢測等特點。目前，國內外尚未見LAMP方法檢測NDM-1基因的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種高特異性檢測NDM-1基因的引物組合物及其應用。

本發明提供的輔助檢測NDM-1蛋白(新德里金屬-β-內酰胺酶1)的編碼基因的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成。

本發明還保護一種輔助檢測NDM-1蛋白的編碼基因的試劑盒，包括所述的專用引物。

所述專用引物可用于制備輔助檢測NDM-1蛋白的編碼基因的試劑盒。

所述專用引物或所述試劑盒可用于輔助檢測NDM-1蛋白的編碼基因。

所述專用引物或所述試劑盒可用于輔助鑒定含有NDM-1蛋白的編碼基因的生物樣本。

所述NDM-1蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質：

(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)將序列7的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質。

所述NDM-1蛋白的編碼基因為如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：

(1)序列表中序列8所示的DNA分子；

(2)序列表的序列8自5’末端第14至826位核苷酸所示的DNA分子；