[發(fā)明專利]硝基呋喃類藥物代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110108477.8
• 申請(qǐng)日: 2011-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN102759622A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳立柱;楊利;李峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寶瑞源生物技術(shù)(北京)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/532
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層技術(shù)制作的一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

硝基呋喃類藥物為一種光譜抗生素，主要是指呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林，具有很好的抗菌作用，被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑和治療藥物，用于預(yù)防和治療由沙門氏菌和埃希氏桿菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病。他們對(duì)人類健康有惡性影響，有致癌性。歐盟出于食品安全的考慮，在96/23/EC法規(guī)中將硝基呋喃類抗生素列為A類禁用藥，決定從1997年1月1日起，禁止在動(dòng)物飼料中添加任何硝基呋喃類抗生素。我國(guó)也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。歐盟委員會(huì)于2003年通過了2003/181/EC委員會(huì)決議，建立了用于檢測(cè)禽肉產(chǎn)品和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物的各種方法的最小要求性能限值為1μg/kg。目前，歐盟、美國(guó)及其他國(guó)家都對(duì)進(jìn)口動(dòng)物性食品中硝基呋喃類抗生素殘留做了非常嚴(yán)格的限制，要求4種硝基呋喃代謝物殘留不得超過1μg/kg。

為了人和動(dòng)物的安全很有必要對(duì)水源和食品(如：肉)進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè)。硝基呋喃類藥物本身的檢測(cè)很難，因?yàn)樵谑橙脒@些藥物后會(huì)很快地發(fā)生代謝。這些代謝產(chǎn)物會(huì)在組織中存在很長(zhǎng)時(shí)間。AOZ是呋喃唑酮代謝物、AMOZ是呋喃它酮的代謝物、SEM是呋喃西林代謝物、AHD是呋喃妥因代謝物。因此，可以通過檢測(cè)食品中是否含有硝基呋喃類藥物代謝物以判定食品對(duì)人體的安全性。

目前，檢測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)。這些方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但是具有需要昂貴的儀器，檢測(cè)繁瑣、費(fèi)時(shí)，檢測(cè)人員需要一定的專業(yè)培訓(xùn)等缺點(diǎn)。

本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術(shù)制備了一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高、無需復(fù)雜儀器等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、成本低的硝基呋喃類藥物代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

硝基呋喃類藥物代謝物檢測(cè)試劑盒由呋喃唑酮代謝物檢測(cè)試紙條、呋喃它酮的代謝物檢測(cè)試紙條、呋喃西林代謝物檢測(cè)試紙條、呋喃妥因代謝物檢測(cè)試紙條組裝而成，每種試劑條由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，其中檢測(cè)線(T線)上包被了硝基呋喃類藥物代謝物偶聯(lián)載體蛋白，質(zhì)控線(C線)上包被了羊抗鼠IgG抗體；所述吸樣墊為吸水紙。

偶聯(lián)硝基呋喃類藥物代謝物的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)。

本發(fā)明采用納米膠體金技術(shù)及抗原抗體特異性反應(yīng)，應(yīng)用免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)的原理制備而成，通過待檢樣本中可能含有的硝基呋喃類藥物代謝物與硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(T線)包被的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯(lián)載體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的硝基呋喃類藥物代謝物抗體的反應(yīng)，使T線顯現(xiàn)肉眼可見紅色條帶用于判定待檢樣本中是否含有硝基呋喃類藥物代謝物。

本發(fā)明提供了一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備硝基呋喃類藥物代謝物偶聯(lián)載體蛋白

硝基呋喃類藥物是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才能具有免疫原性。因此采用活性酯法將硝基呋喃類藥物代謝物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到硝基呋喃類藥物代謝物偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原和包被原。其中載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)。

(2)制備硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體

采用硝基呋喃類藥物代謝物偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原免疫BALB/C小鼠，制備硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體。

(3)制備膠體金

取0.01％的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。

(4)制備膠體金墊