[發明專利]一種卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法

無效

• 申請號: 201110107772.1
• 申請日: 2011-04-27
• 公開（公告）號: CN102206609A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發明（設計）人: 鄭月茂;賀小英;鄭艷玲;劉軍;張涌
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

發明屬于雌性生殖干細胞技術領域，涉及一種卵巢來源雌性生殖干細胞(female?germline?stem?cells，FGSCs)的分離培養方法。

背景技術

生殖干細胞是各級生殖細胞發生、發育和分化的源泉。傳統觀點認為，女性和絕大多數雌性哺乳動物卵母細胞的產生僅發生在胎兒期，出生后卵母細胞數目不再增加，反而逐年減少，這意味著出生后卵巢無生殖干細胞存在。2004年，科學家發現幼鼠及成年鼠卵巢中包含具有有絲分裂活性的生殖細胞，并可持續更新卵泡池，即卵巢上有干細胞。美國德克薩斯州及中國中山大學研究者已從小鼠和人體卵巢中分離獲得了生殖干細胞，并成功誘導為不同分化階段的生殖細胞。2009年4月12日，國際著名期刊Nature?Cell?Biology網絡版公布了上海交通大學吳際教授研究團隊的一項研究成果，該研究證明，卵巢中的干細胞能在器皿中繁殖，干細胞轉移到卵巢后，能夠發展成自行發育的卵子，產生后代。這一驚人發現改變了人們的傳統觀點，開辟出一個嶄新的研究領域。該研究成果能為動物生物技術和人類提供卵母細胞新來源，對通過性細胞途徑制作轉基因動物、開發優良動物品種、瀕危動物的保存、動物繁殖等都具有重要意義。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，開辟了分離培養雌性生殖干細胞的新途徑，本方法從卵巢中分離培養雌性生殖干細胞成功率高。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，包括以下步驟：

將成年家畜卵巢的表面上皮層剪碎后置于HBSS液中，依次用IV型膠原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化，待細胞分散開后，加入胎牛血清終止消化，離心去除上清液，重懸沉淀物(卵巢表面上皮層細胞，含有雌性生殖干細胞)后過濾去掉細胞團，將分離獲得的細胞以4～6×10²個細胞/mL的濃度接種于含有胎兒成纖維細胞飼養層的培養板中，加入雌性生殖干細胞培養液，于37℃、5％CO₂的飽和濕度培養箱中培養；

每2～3d更換一次培養液，當培養板鋪滿單層細胞時，吸棄培養液，加入細胞分離無酶緩沖液，待全部細胞脫壁后，再反復吹吸，使細胞盡量分散；收集細胞懸液，離心去除上清，收集細胞得到雌性生殖干細胞；

所述的雌性生殖干細胞培養液是以MEM?α-medium為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數10～20％的胎牛血清、1～2mmol/L丙酮酸鈉、1～2mmol/L非必需氨基酸、2～5mmol/L?L-谷氨酰胺、0.1～1mmol/L?β-巰基乙醇、10～50ng/mL人重組白血病抑制因子、6～10μg/mL胰島素-轉鐵蛋白-硒鈉、10～50ng/mL表皮生長因子、40～100ng/mL膠質細胞源性神經營養因子、1～2ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和15～50mg/L青霉素

所述的胎兒成纖維細胞飼養層為：用終濃度為15～20mg/L的絲裂霉素C處理傳代培養3代以內的胎兒成纖維細胞2～3h后，再用PBS洗滌胎兒成纖維細胞完全去除絲裂霉素C，然后加入胰蛋白酶液孵育消化，待細胞收縮變圓后終止消化，離心后收集細胞，再用胎兒成纖維細胞培養液重懸細胞；調整細胞密度為2.5～5×10⁵細胞/孔種植于經明膠包被的培養板中，置37℃、5％CO₂恒溫培養箱培養24h后，作為飼養層細胞；

所述的胎兒成纖維細胞培養液是以高糖DMEM為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數10％的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和1ng/mL堿性成纖維細胞生長因子。

所述的雌性生殖干細胞培養液是以MEM?α-medium為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數10％的胎牛血清、1mmol/L丙酮酸鈉、1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L?L-谷氨酰胺、0.1mmol/L?β-巰基乙醇、10ng/mL人重組白血病抑制因子、6μg/mL胰島素-轉鐵蛋白-硒鈉、10ng/mL表皮生長因子、40ng/mL膠質細胞源性神經營養因子、1ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和15mg/L青霉素。

雌性生殖干細胞的擴增培養為：用雌性生殖干細胞培養液將雌性生殖干細胞稀釋制成1～5×10³個細胞/mL的細胞懸浮液，將細胞懸浮液加入到培養板中，在37℃、5％CO₂恒溫培養箱中擴增培養。

所述的依次用IV型膠原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化為：