[發明專利]一種卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法

無效

• 申請號: 201110107772.1
• 申請日: 2011-04-27
• 公開（公告）號: CN102206609A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發明（設計）人: 鄭月茂;賀小英;鄭艷玲;劉軍;張涌
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

將成年家畜卵巢的表面上皮層剪碎后置于HBSS液中，依次用IV型膠原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化，待細胞分散開后，加入胎牛血清終止消化，離心去除上清液，用雌性生殖干細胞培養液重懸沉淀物后過濾去掉細胞團，將分離獲得的細胞以4～6×10²個細胞/mL的濃度接種于含有胎兒成纖維細胞飼養層的培養板中，加入雌性生殖干細胞培養液，于37℃、5％CO₂的飽和濕度培養箱中培養；

每2～3d更換一次培養液，當培養板鋪滿單層細胞時，吸棄培養液，加入細胞分離無酶緩沖液，待全部細胞脫壁后，再反復吹吸，使細胞盡量分散；收集細胞懸液，離心去除上清，收集細胞得到雌性生殖干細胞；

所述的雌性生殖干細胞培養液是以MEM?α-medium為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數10～20％的胎牛血清、1～2mmol/L丙酮酸鈉、1～2mmol/L非必需氨基酸、2～5mmol/L?L-谷氨酰胺、0.1～1mmol/L?β-巰基乙醇、10～50ng/mL人重組白血病抑制因子、6～10μg/mL胰島素-轉鐵蛋白-硒鈉、10～50ng/mL表皮生長因子、40～100ng/mL膠質細胞源性神經營養因子、1～2ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和15～50mg/L青霉素；

所述的胎兒成纖維細胞飼養層為：用終濃度為15～20mg/L的絲裂霉素C處理傳代培養3代以內的胎兒成纖維細胞2～3h后，再用PBS洗滌胎兒成纖維細胞完全去除絲裂霉素C，然后加入胰蛋白酶液孵育消化，待細胞收縮變圓后終止消化，離心后收集細胞，再用胎兒成纖維細胞培養液重懸細胞；調整細胞密度為2.5～5×10⁵細胞/孔種植于經明膠包被的培養板中，置37℃、5％CO₂恒溫培養箱培養24h后，作為飼養層細胞；

所述的胎兒成纖維細胞培養液是以高糖DMEM為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數10％的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和1ng/mL堿性成纖維細胞生長因子。

2.如權利要求1所述的卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述的雌性生殖干細胞培養液是以MEM?α-medium為基礎培養基，還包括以下組分：體積分數10％的胎牛血清、1mmol/L丙酮酸鈉、1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L?L-谷氨酰胺、0.1mmol/L?β-巰基乙醇、10ng/mL人重組白血病抑制因子、6μg/mL胰島素-轉鐵蛋白-硒鈉、10ng/mL表皮生長因子、40ng/mL膠質細胞源性神經營養因子、1ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和15mg/L青霉素。

3.如權利要求1所述的卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，雌性生殖干細胞的擴增培養為：用雌性生殖干細胞培養液將雌性生殖干細胞稀釋制成1～5×10³個細胞/mL的細胞懸浮液，將細胞懸浮液加入到培養板中，在37℃、5％CO₂恒溫培養箱中擴增培養。

4.如權利要求1所述的卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，依次用IV型膠原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化為：

將剪碎后的卵巢的表面上皮層先置于含1mg/mL?IV型膠原酶的HBSS液中，于37℃孵育消化10～15min后，然后用HBSS液沖洗2～4次，再置于含有1mmol/L?EDTA和0.05％胰酶的HBSS液中，于37℃孵育10～15min。

5.如權利要求1所述的卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述的胎兒成纖維細胞的傳代培養為：用胎兒成纖維細胞培養液將分離白30～40d家畜胎兒的成纖維細胞調整為3～5×10⁵個/mL的細胞懸液，將細胞懸液加入到明膠包被過的培養板中，置于37℃、5％CO₂、飽和濕度條件下培養并傳代。

6.如權利要求1所述的卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，胎兒成纖維細胞完全去除絲裂霉素C之后加入的胰蛋白酶液包含0.5g/L胰蛋白酶和質量分數為0.02％的EDTA。

7.如權利要求1所述的卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述的家畜為豬或山羊。

8.如權利要求1所述的卵巢來源雌性生殖干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述的卵巢表面上皮層與胎兒成纖維細胞取自同一種家畜。