[發明專利]BK通道阻斷劑基因、其重組載體及其克隆方法

無效

• 申請號: 201110107768.5
• 申請日: 2011-04-28
• 公開（公告）號: CN102242125A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 吉永華;沈昊;周智磊;董邦乾;嚴麗
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/10;C12N15/66
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域

本發明涉及一種新型BK通道阻斷劑martentoxin基因、其重組載體及其克隆方法。

背景技術

?大電導鈣激活鉀通道（簡稱BK通道）是廣泛分布于興奮性和非興奮性細胞中的一種受電壓和鈣離子雙重門控的鉀離子通道，具有調節神經細胞興奮性、平滑肌的舒張；控制神經遞質的釋放、激素的分泌；參與非特異性免疫等功能。功能性的BK通道至少由四個α亞基構成，每個α亞基均有10個疏水性α-螺旋結構；輔助性β亞基通常呈組織特異性表達，每個β亞基均由胞外環連接兩個跨膜α-螺旋疏水性片段(Lippiat,Standen?et?al.2003)。α與β亞基共表達，可顯著改變BK通道的動力學和藥理學特點。

值得指出的是，特異性分布于神經系統中的BK通道亞型（由α和β4亞基共表達構成）被認為具有重要的生理與藥理功能效應。這種通道亞型基因欠缺可導致一系列臨床疾病。神經系統的BK通道具有較慢的生理動力學特征，且該BK通道亞型對包括經典的iberiotoxin和charybdotoxin等經典的BK通道阻斷劑均呈現出相當的非敏感性。因此，為了精確探明該BK通道亞型的生理與藥理功能特性，以利設計研發相關臨床BK通道疾病的針對性藥物，開發BK通道的特異性阻斷劑、解析其分子機制、鑒定BK通道上新的藥物專一性、藥物作用方式、藥物作用新靶點、BK通道-阻斷劑相互作用新模式，不僅可深度拓展有關BK通道立體結構與功能的知識，為相關BK通道病的診斷與治療提供細胞與分子學依據,?還可對相應的特異性藥物設計提供有益的參考思路Kraft,Krause?et?al,2003。

野生型的martentoxin?是由東亞鉗蝎粗毒中純化出來的一個37肽阻斷劑，分子量為4060?Da，其全長cDNA?開放閱讀框長為177?bp，編碼59個氨基酸殘基的前體（內含22個氨基酸殘基的信號肽和37個氨基酸殘基的成熟肽），已被鑒定可特異性地作用于大鼠嗜鉻細胞的鈣激活K⁺?通道(Ji,Wang?et?al,2003)。以charybdotoxin為對照，100?nM?martentoxin可以阻遏70%的BK電流，相當于charybdotoxin的77%活性。但在NG-108細胞和大鼠背根神經節細胞上，martentoxin對于Kv的作用微乎其微。Biosensor結合實驗表明，martentoxin與大鼠腦突觸體膜的結合能力比遠遠高于charybdotoxin，但對于BK亞型，兩者藥理效應對應互補，400?nM?martentoxin可高選擇性阻斷BK通道（α+β4）電流，這提示martentoxin有可能和一種charybdotoxin非敏感的K⁺?通道高度親和。所以martentoxin可以作為研究K⁺?通道分型、電信號和化學信號的一個重要阻斷劑Shi,He?et?al.2008?。對其進行基因工程表達，便于對其結構和功能進行研究，同時可以進行突變操作，研究特定鉀通道的結構和功能。利用原核表達系統，探索簡單易行的體外表達程序，使martentoxin得以在體外表達，從而為解決天然阻斷劑的稀有性，以及下一步的阻斷劑結構與功能的研究提供必要的前提條件。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種BK通道阻斷劑基因。

本發明的目的之二在于提供該基因的重組載體。

本發明的目的之三在于提供該BK通道阻斷劑基因的克隆方法

本發明的目的之三在于提供BK通道阻斷劑基因重組載體的克隆方法。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種BK通道阻斷劑基因，其特征在于該基因為SEQ?ID?NO：1?所示的堿基序列。

一種上述的BK通道阻斷劑基因的重組載體基因，其特征在于該重組載體基因為SEQ?ID?NO：2?所示的堿基序列。

一種宿主細胞，其特征在于該宿主細胞含有權利要求2所述的重組載體。

一種克隆上述的BK通道阻斷劑基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：使用5’-?ATTGAAGCTTACGCGTCGACTATA（dT）-3’引物逆轉錄野生東亞鉗蝎總RNA，獲得BK通道阻斷劑基因。

一種克隆上述的重組載體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：