[發明專利]一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物及其鑒別方法

無效

• 申請號: 201110107296.3
• 申請日: 2011-04-27
• 公開（公告）號: CN102304562A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 程起群;黃昊;鄭將臣
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明屬鯖屬魚類的鑒別技術領域，特別是涉及一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物和鑒別方法。

背景技術

日本鯖(S.japonicus)與澳洲鯖(S.australasicus)在中國漁業經濟中占有重要地位，其分類依據主要是傳統的分類方法，利用“日本鯖腹部無斑點，澳洲鯖腹部具斑點”作為鑒別二者的最重要依據。由于兩者形態特別相似，而且二者往往存在中間過渡類型，使得傳統的分類方法不容易區分兩者，這也導致兩者的分類地位一直存有爭議。日本鯖和澳洲鯖的不易區分，直接導致在漁業資源調查中，經常將二者作為一種漁業資源進行統計。顯然，這對于有效管理和可持續利用日本鯖和澳洲鯖漁業資源十分不利。

在過去的數十年中，學者往往都是用形態可數性狀和PCR-RFLP技術來鑒別鯖科魚類，但上述各方法在種類鑒定時都存在一定的缺陷。例如：由于中間過渡類型的存在，使得基于形態斑點有無的方法，很難區分日本鯖和澳洲鯖；BAKER等利用第一背鰭棘數和第一背鰭與第二背鰭間的脈間骨(interneural?bone)(澳洲鯖：30～33；日本鯖：26～29)數目區分印度洋及紅海的澳洲鯖和日本鯖。但二者脈間骨數目相近，該方法容易出現計數錯誤。FUTOSHI利用PCR-RFLP技術鑒別日本鯖，澳洲鯖以及大西洋鯖。但該方法首先需自行設計特異性引物，然后通過繁瑣的軟件尋找合適的限制性內切酶特異性的切割三種魚類DNA，并且電泳檢測才能顯示最終結果。

為有效管理和可持續利用日本鯖和澳洲鯖漁業資源，有必要查明日本鯖、澳洲鯖二者的差異，建立準確高效的線粒體控制區(D-loop)鑒別標記，從而為有效管理和合理的開發利用兩種鯖魚資源提供理論基礎。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物和鑒別方法，該方法簡單、快速、準確、高效。

本發明的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物，引物序列為：

FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’。

本發明的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，包括：

(1)提取日本鯖與澳洲鯖肌肉組織中總基因組DNA；

(2)PCR擴增反應

引物序列為：

FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’；

(3)PCR產物測序及校對

將上述PCR產物用含EB(溴化乙錠)的0.8％瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，在測序儀上進行雙向測序，其測序引物仍為PCR擴增引物，測序結果經校對拼接后，用軟件進行比對，獲得一致序列；

(4)D-loop堿基矩陣的構建

通過軟件統計兩種鯖魚的變異位點，找出各自的固定位點，構建堿基矩陣。

所述步驟(1)采用酚氯仿法抽提DNA。

所述步驟(2)中的PCR擴增反應的反應體系包括：100ngDNA模板，0.2mmol/L?dNTPs，引物各1.0umol/L，4.0mmol/L?MgCl₂，5.0uL10×reaction?buffer(反應緩沖液)，2U?Taq聚合酶，然后加去離子水至終體積50uL。

所述步驟(2)中的擴增程序如下：94℃預變性5min；94℃變性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃延伸10min。

所述步驟(3)優選使用Clustal?X軟件比對。

所述步驟(4)優選使用MEGA4.0軟件統計變異位點。

通過本發明方法獲得D-loop全序列后，第4位，日本鯖全部為C，而澳洲鯖全部為T，這第4位就是兩種鯖魚的鑒別標記。

MCDONALD和KREITMAN將種內個體間無堿基差異而種間有明顯堿基差異的位點，定義為固定位點(fixation?site)，并將其作為種間差異的標志，用以區分種內差異和種間差異。利用固定位點鑒別物種簡單，快速，準確，其最突出的優點是只需建立一個“堿基矩陣”就能高效的區別相似物種。