[發(fā)明專利]一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物及其鑒別方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201110107296.3 | 申請日： | 2011-04-27 |
| 公開（公告）號： | CN102304562A | 公開（公告）日： | 2012-01-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 程起群;黃昊;鄭將臣 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233 | 代理人： | 黃志達;謝文凱 |
| 地址： | 200090 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 日本 澳洲 鑒別 引物 及其 鑒別方法 | ||
1.一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別引物，其特征在于：引物序列為，
FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’。
2.一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，包括：
(1)提取日本鯖與澳洲鯖肌肉組織中總基因組DNA；
(2)PCR擴增反應(yīng)
引物序列為，
FP：5’-TTCCTATTTTGAACCCTTGTCG-3’；RP：5’-GCGTCGTGGGCTTCTGTAT-3’；
(3)PCR產(chǎn)物測序及校對
將上述PCR產(chǎn)物用含EB(溴化乙錠)的0.8％瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，在測序儀上進行雙向測序，其測序引物仍為PCR擴增引物，測序結(jié)果經(jīng)校對拼接后，用軟件進行比對，獲得一致序列；
(4)D-loop堿基矩陣的構(gòu)建
通過軟件統(tǒng)計兩種鯖魚的變異位點，找出各自的固定位點，構(gòu)建堿基矩陣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于：所述步驟(1)采用酚氯仿法抽提DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于：所述步驟(2)中的PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：100ngDNA模板，0.2mmol/L?dNTPs，引物各1.0umol/L，4.0mmol/L?MgCl2，5.0uL10×reaction?buffer，2U?Taq聚合酶，然后加去離子水至終體積50uL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于：所述步驟(2)中的擴增程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于：所述步驟(3)使用Clustal?X軟件比對。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于：所述步驟(4)使用MEGA4.0軟件統(tǒng)計變異位點。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本鯖和澳洲鯖的鑒別方法，其特征在于：在獲得D-loop全序列后，第4位，日本鯖全部為C，而澳洲鯖全部為T，第4位即為兩種鯖魚的鑒別標記。
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