[發(fā)明專(zhuān)利]干細(xì)胞篩選系統(tǒng)、其制備方法及干細(xì)胞的篩選方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110106899.1
• 申請(qǐng)日: 2011-04-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102212460A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉蘭濤;黃博;周躍;李長(zhǎng)青;熊承杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12M1/00
• 分類(lèi)號(hào): C12M1/00;C12N5/0775
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 逯長(zhǎng)明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細(xì)胞篩選技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng)、其制備方法及干細(xì)胞的篩選方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，MSC)是來(lái)源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛存在于人體結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。間充質(zhì)干細(xì)胞具有高分化性能，在不同的誘導(dǎo)條件下能分化成成熟的間質(zhì)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。作為進(jìn)行組織工程研究的重要種子細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞在骨及軟骨組織損傷的修復(fù)、肌肉組織退行性疾病、冠心病等疾病的治療方面具有良好的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了多種間充質(zhì)干細(xì)胞的篩選方法，如密度梯度離心法、全血貼壁法、流式分選法和免疫磁珠篩選法等，其中，篩選軟骨干細(xì)胞的方法主要有流式分選法、免疫磁珠篩選法和瓊脂糖篩選法。瓊脂糖篩選法主要包括以下步驟：將含有一定細(xì)胞量的DEME/F12培養(yǎng)液與等體積的2％低熔點(diǎn)瓊脂糖充分混合，使細(xì)胞在瓊脂糖篩選系統(tǒng)中成為單細(xì)胞狀態(tài)；瓊脂糖的濃度達(dá)到1％后，將篩選系統(tǒng)在4℃下靜置10min凝固；然后加入DEME/F12培養(yǎng)液，于溫箱中培養(yǎng)3周～6周；最后在倒置顯微鏡下提取細(xì)胞克隆團(tuán)，即可得到軟骨干細(xì)胞。瓊脂糖篩選法不僅操作過(guò)程繁瑣、篩選時(shí)間長(zhǎng)，而且需要嚴(yán)格控制篩選條件，即便嚴(yán)格控制篩選條件，由于需要在倒置顯微鏡下提取細(xì)胞克隆團(tuán)，在提取過(guò)程中軟骨干細(xì)胞易受污染、純度較低。

流式分選法是通過(guò)流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行干細(xì)胞篩選的方法，免疫磁珠篩選法是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用包備有抗體的磁珠與干細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志特異結(jié)合后，通過(guò)一定強(qiáng)度磁場(chǎng)時(shí)被滯留而分選的方法，流式分選法和免疫磁珠篩選法能夠簡(jiǎn)化篩選步驟，提高篩選效率，但是，由于軟骨干細(xì)胞缺乏特異性的標(biāo)志物，采用流式分選法和免疫磁珠篩選法進(jìn)行篩選得到的干細(xì)胞純度較低；而且流式分選法和免疫磁珠篩選法需要的細(xì)胞量大，不利于篩選組織塊較小的組織。另外，流式分選法和免疫磁珠篩選法需要特定設(shè)備儀器和抗體試劑，篩選成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng)、其制備方法及干細(xì)胞的篩選方法，本發(fā)明提供的篩選方法無(wú)需特定儀器設(shè)備和抗體試劑，流程簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，得到的干細(xì)胞純度高。

本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞篩選系統(tǒng)，包括：

固體支持物；

涂布在所述固體支持物上的纖維連接蛋白和牛血清白蛋白。

本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

將纖維連接蛋白與緩沖溶液混合，得到纖維連接蛋白溶液；

將所述纖維連接蛋白溶液加入到固體支持物中進(jìn)行孵育，得到涂布有纖維連接蛋白的固體支持物；

向所述涂布有纖維連接蛋白的固體支持物中加入牛血清白蛋白，得到干細(xì)胞篩選系統(tǒng)。

優(yōu)選的，所述纖維連接蛋白溶液的濃度為5μg/mL～20μg/mL。

優(yōu)選的，所述孵育的溫度為0℃～5℃，所述孵育的時(shí)間為10h以上。

本發(fā)明還提供了一種干細(xì)胞的篩選方法，包括以下步驟：

a)提供軟骨終板細(xì)胞重懸液；

b)將所述軟骨終板細(xì)胞重懸液加入到權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)所述的干細(xì)胞篩選系統(tǒng)中進(jìn)行孵育，得到干細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述步驟b)中，所述軟骨終板細(xì)胞終濃度為200個(gè)細(xì)胞/cm²～600個(gè)細(xì)胞/cm²。

優(yōu)選的，所述步驟b)中，所述孵育的溫度為35℃～38℃，所述孵育的時(shí)間為5min～30min。

優(yōu)選的，所述步驟a)具體包括：

a1)用膠原酶將軟骨終板進(jìn)行消化，離心后得到軟骨終板細(xì)胞團(tuán)；

a2)用DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述軟骨終板細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行重懸，得到軟骨終板細(xì)胞重懸液。

優(yōu)選的，還包括：

對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

優(yōu)選的，采用含有5wt％～20wt％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。