[發(fā)明專利]一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法

有效

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• 申請日: 2011-04-27
• 公開（公告）號: CN102229923A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 須丹丹;劉錚;盧滇楠
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法。

背景技術(shù)

脂肪酶(Lipase)作為應用最為廣泛的工業(yè)酶之一，可以催化水解、酯化等多種反應過程，并且具有較高的手性/區(qū)域選擇性。其常見應用領域包括有機合成、食品工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、能源工業(yè)、生物轉(zhuǎn)化、生物醫(yī)藥、生物傳感器等等?；瘜W修飾法是酶分子改造過程中的常見方法，且隨著近年來納米科技的發(fā)展，納米高分子生物催化顆粒正逐漸成為生化催化領域一個新型課題。脂肪酶納米高分子生物催化顆粒不僅可以有效實現(xiàn)均相催化，解決現(xiàn)有固定化脂肪酶因高傳質(zhì)阻力而導致酶催化活性較低的問題，而且還可以有效提高熱穩(wěn)定性，增強有機溶劑耐受能力。傳統(tǒng)兩步法制備脂肪酶納米高分子生物催化顆粒采用丙烯酸琥珀酰亞胺酯作為第一步引入蛋白質(zhì)表面雙鍵基團的修飾劑，然后經(jīng)過中間產(chǎn)物分離后進入第二步水相原位自由基聚合得到目標產(chǎn)物。該方法的修飾劑成本高，中間分離步驟耗時長，嚴重制約了其在實際工業(yè)生產(chǎn)中的應用。因此，開發(fā)一種原料成本低、工藝簡單、能耗少的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的制備方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法。

本發(fā)明所提供的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒，是以下述質(zhì)量份的物質(zhì)為原料制成的：脂肪酶10份、甲基丙烯酸縮水甘油酯(酶修飾劑)2-200份、乙烯基單體75-375份和引發(fā)劑體系20-30份；具體制備方法包括如下步驟：1)將所述脂肪酶和所述甲基丙烯酸縮水甘油酯加入pH值為3-8的緩沖溶液中，在0-50℃下反應0.5～3小時；2)向步驟1)的反應液中加入所述乙烯基單體和所述引發(fā)劑體系，在0-50℃繼續(xù)反應5-12小時，得到脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。

其中，所述酶修飾劑甲基丙烯酸縮水甘油酯是以甲基丙烯酸縮水甘油酯的二甲基甲酰胺溶液形式加入的，由于二甲基甲酰胺與修飾劑以及水的互溶性較好，所以作為修飾劑的溶劑，可促進其在水相中溶解并與脂肪酶反應。

本發(fā)明中所述脂肪酶來源于商品酶、動物提取物或微生物提取物。

本發(fā)明中，所述乙烯基單體是指可通過自由基聚合反應形成聚合物的乙烯基單體；所述乙烯基單體具體可選自下述至少一種：丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯?；垡叶肌⒓谆┧?、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、順丁二烯和三羥基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。

本發(fā)明中，所述引發(fā)劑體系是指在0-50℃條件下能夠引發(fā)產(chǎn)生自由基，導致乙烯基單體發(fā)生自由基聚合的熱引發(fā)劑體系或氧化還原引劑體系。所述引發(fā)劑體系具體可由下述A和B中的物質(zhì)組成，所述A選自下述至少一種：過硫酸鉀、過硫酸銨、過氧化氫、叔丁基過氧化氫和過氧化苯二甲酰，所述B選自下述至少一種：亞鐵鹽、亞硫酸鹽、N，N’-二甲基苯胺、氨水、N，N’-二甲基-對甲苯胺、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基嗎啉。所述引發(fā)劑體系優(yōu)選由過硫酸銨和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺組成，其質(zhì)量比可為1.5∶2。

所述緩沖溶液可為下述至少一種物質(zhì)的水溶液：醋酸、醋酸鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鈉、硼酸、硼酸鈉、硼酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀和碳酸氫鉀。

所述方法還包括將步驟2)得到的含脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的反應液進行透析，并將透析后的液體凍干的步驟。

在本發(fā)明提供的制備方法中，乙烯基單體也可在步驟1中加入，具體方法如下：

1)將所述脂肪酶、所述甲基丙烯酸縮水甘油酯和所述乙烯基單體加入pH值為3-8的緩沖溶液中，在0-50℃下反應0.5～3小時；2)向步驟1)的反應液中加入所述引發(fā)劑體系，在0-50℃繼續(xù)反應5-12小時，得到脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。

上述先加入乙烯基單體的方法較后加入乙烯基單體的方法，聚合反應收率較低，從最終聚合產(chǎn)物收率方面考慮，優(yōu)選后加入乙烯基單體的方法。

本發(fā)明采用疏水性試劑甲基丙烯酸縮水甘油酯作為酶修飾劑，在脂肪酶表面引入碳碳雙鍵基團，無需中間產(chǎn)物分離，直接加入含有碳碳雙鍵的乙烯基單體引發(fā)自由基聚合，得到目標脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。該脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的粒徑為20-50nm，其核心為脂肪酶，外殼為高分子材料，核殼之間有化學鍵連接。