[發明專利]一種轉基因植物分子水平非預期效應評價的方法

有效

• 申請號: 201110104793.8
• 申請日: 2011-04-26
• 公開（公告）號: CN102251025A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 王戎疆;許崇任;韓娟;甄剛
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其是涉及一種轉基因植物安全性評價方法，具體是轉基因植物分子水平的非預期效應評價的方法。

背景技術

按照聯合國糧農組織(FAO)的定義，生物安全是指“避免由于對具有感染能力的有機體或者遺傳修飾有機體的研究和商品化生產而對人類的健康和安全以及環境的保護帶來的風險”，可歸納為生態風險、食品安全和非預期效應三個方面。在轉基因植物安全性評價的諸多項目中，非預期效應的評價是難度最高的項目，其原因在于轉基因植物的非預期效應具有顯著的難以預測性(European?foodsafety?authority，2005；，2004)。根據聯合國糧農組織和世界衛生組織(FAO/WHO)的定義，轉基因生物非預期效應是指由外源基因整合于基因組導致的非目標性狀的增加或者導致受體植物存在的性狀的丟失(WHO，2000)。

現在實驗室中及世界各國環境和食品監管部門在研究和檢測轉基因植物非預期效應時所使用的方法和技術主要包括：1、基于靶標的表型篩選。首先考察轉基因植株整體表型與非轉基因植株是否存在顯著差異，即農藝性狀有沒有退化；然后鑒定目標性狀是否被無誤的引入受體植物。2、主要成分比較分析法。即基于實質等同性原則對轉基因植物及其非轉基因受體在組分上進行比較分析，這些主要成分包括脂肪、蛋白質、碳水化合物、礦物質、灰分、氨基酸、脂肪酸和維生素等。3、組學和譜學的方法，包括轉錄組學(基因芯片)、蛋白質組學(雙向電泳)、代謝組學(代謝物譜系分析)。其實質也是基于實質等同性原則進行的比較法。以蛋白質組學為例，即用雙向電泳技術考察轉基因植物與其非轉基因受體之間在表達譜上是否存在差異點。(參考文獻：F.Cellini，A.Chesson，I.Colquhoun，etal，.2004.Unintended?effects?and?their?detection?in?genetically?modifiedcrops[J].Food?and?Chemical?Toxicology.42：1089-1125.Deng?PJ，Zhou?XY，Yang?DY，et?al，.2008.The?definition，source，manifestationand?assessment?of?unintended?effects?in?genetically?modified?plants[J].Journal?ofthe?Science?of?Food?and?Agriculture.88：2401-2413.)。

上述所有方法的思路都是從結果入手，先分析一個結果性事件對另一個結果性事件是否存在影響，然后從出發的結果上找原因，并試圖研究這個原因是否同時是終點的結果的原因。在這一過程中間，就存在由各通路鏈條的“黑盒子”而導致的結論不確定性。

發明內容

本發明的目的是提供一種評價轉基因植物分子水平非預期效應的方法，以克服現有技術存在的上述不足。

為實現上述目的，本發明的技術方案是：利用酵母雙雜交的方法，首先對外源目的蛋白克隆與鑒定，構建為誘餌融合蛋白，再將轉基因植物受體親本的cDNA文庫構建獵物融合蛋白，最后用誘餌融合蛋白對獵物融合蛋白文庫進行篩選，通過對轉基因植物受體親本cDNA文庫的篩選，獲得與外源目的蛋白相互作用的陽性作用子(見圖1)。本發明直接考察外源蛋白與受體植物蛋白組的相互作用，這樣從確定的原因著手，通過設計的實驗得到明確的結果，從而在分子水平得到評價非預期效應的確定性結論，實現對轉基因植物分子水平的非預期效應評價。在此基礎上，通過遺傳學和分子生物學等技術的研究可以得到轉基因植物表型的非預期改變，從而進行轉基因植物表型水平非預期效應的確定性結論。

本發明具體包括以下步驟：

1、外源目的蛋白的克隆與鑒定

外源目的蛋白是指轉基因植物中插入的目標性狀。從轉基因植物或外源目的蛋白的原始來源處通過PCR或基因分離的方法獲得目標蛋白的基因序列，轉化大腸桿菌克隆擴增，再通過PCR、瓊脂糖電泳、序列測定、序列比對分析鑒定目的片段。

2、外源目的蛋白構建誘餌融合蛋白