[發明專利]一種轉基因植物分子水平非預期效應評價的方法

有效

• 申請號: 201110104793.8
• 申請日: 2011-04-26
• 公開（公告）號: CN102251025A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 王戎疆;許崇任;韓娟;甄剛
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

1.一種轉基因植物分子水平非預期效應評價的方法，其特征在于，用外源目的蛋白構建誘餌融合蛋白，用轉基因植物受體親本cDNA文庫構建獵物融合蛋白文庫，通過酵母雙雜交用誘餌融合蛋白對獵物融合蛋白文庫進行篩選，獲得陽性相互作用蛋白，從而實現對轉基因植物分子水平非預期效應的評價。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將外源基因連接到具有編碼DNA結合功能域基因的酵母雙雜交質粒上構建得到表達誘餌融合蛋白的表達質粒，將cDNA文庫的基因連接到的具有編碼DNA轉錄激活結構域基因的酵母雙雜交質粒上構建得到表達獵物融合蛋白的表達質粒，將這兩種質粒共轉化酵母中，篩選陽性克隆，獲得陽性互作蛋白。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA結合功能域為GAL4-bd或LexA-bd，所述DNA轉錄激活結構域為GAL4-ad或VP16。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，構建誘餌融合蛋白表達質粒的方法是：通過PCR特異擴增目的基因，凝膠電泳回收PCR產物，雙酶切同時消化PCR產物和質粒載體pGBKT7，并回收純化線性酶切產物；將載體和目的基因按照1∶3的摩爾比進行連接反應，16℃過夜；連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，于抗性培養基上鑒定陽性克??；液體培養后，提取重組質粒，經過PCR、雙酶切和測序鑒定后，確定為外源目的基因構建的誘餌融合蛋白質粒，最后轉化酵母鑒定外源蛋白重組子的自激活活性和毒性。

5.如權利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，所述cDNA文庫的構建方法是：以轉基因植物受體親本的全株幼苗為材料提取純化總RNA，分離純化mRNA，反轉錄合成單鏈cDNA，利用Gubler-Hoffman法合成ds?cDNA文庫，經末端平滑化，連接接頭、限制性酶切，去除短片段后連接到質粒載體上；將連接產物轉化大腸桿菌，檢測文庫庫容大于1.8×10⁶cfu，并擴增放大cDNA文庫，即為獵物融合蛋白表達文庫。

6.如權利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，用共轉化的方法通過酵母雙雜交進行文庫篩選的方法是：將新鮮復蘇的酵母單菌落在液體培養基中培養至對數生長期，通過去離子水、1×TE/LiAc重懸、洗滌后獲得感受態細胞；然后利用PEG/LiAc介導的方法，將誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白雙質粒系統通過熱擊共轉入新鮮制備的酵母感受態細胞中，最后將轉化后的酵母涂布于培養基上培養；酵母雙雜系統共有四個報告基因-His，-Ade，AUR1-C和MEL1，將共轉化菌液在加有α半乳糖苷酶顯色底物X-α-Gal和抗真菌素金擔子素Aba的雙缺培養基上初篩，篩選能夠生長且變藍的菌落；經過第一輪篩選得到的菌落繼續劃線培養在含X-α-Gal和Aba的四缺培養基上，仍能生長的菌落為初步篩選得到的陽性克隆。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，還包括對初步篩選得到的陽性克隆進一步鑒定：提取所有陽性克隆酵母菌株的質粒，電擊法轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化后菌液涂布LB+Amp的平板，以篩選文庫質粒；每個平板上至少隨機挑取10個單克隆，提取質粒，測序并對序列進行分析；將上述序列分析得到的陽性蛋白的克隆提取質粒分別與表達誘餌融合蛋白的質粒載體共轉化酵母菌株，重復前面的篩選過程。

8.如權利要求2～4任一項所述的方法，其特征在于，所述植物為水稻，所述外源蛋白為CryIAb/Bt，所述具有編碼DNA結合功能域基因的酵母雙雜交質粒為pGBKT7，所述具有編碼DNA轉錄激活功能域基因的酵母雙雜交質粒為pGADT7，所述酵母菌為Y2HGold?yeast?strain。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，得到的陽性互作蛋白有：①金屬硫蛋白類蛋白；②肌醇加氧酶類蛋白；③脂肪酶；④冷素類家族蛋白；⑤稻屬gamma鏈前體類似物；⑥芥子酶前體；⑦二氫吡啶二羧酸合酶1，葉綠體內蛋白前體。