[發明專利]熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201110103579.0
• 申請日: 2011-04-25
• 公開（公告）號: CN102181583A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 劉興友;劉明成;王麗榮;胡建和
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

技術領域

本發明涉及病毒的分子生物學檢測領域，具體涉及一種熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物、探針及試劑盒。

背景技術

熒光定量PCR技術最早由美國Applied?Biosystems公司于1996年推出，是集PCR擴增技術、探針雜交技術和熒光共振能量轉移光譜技術于一體的新興分子生物學檢測方法，其實現了PCR從定性到定量的飛躍。熒光定量PCR技術的原理為：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該方法是目前國際上用在病毒檢測上最先進的檢測方法之一，與普通的PCR擴增技術相比具有無法比擬的優點：（1）特異性高，因為只有當探針與待測模板匹配時Taq酶才會啟動其5’～3’端的外切酶活性，將探針上的熒光基團切割下來而產生熒光強度的增長，因此熒光定量PCR技術克服了普通PCR由于非特異性擴增而導致的假陽性問題；（2）敏感度高，熒光PCR技術可檢出極低拷貝數的核酸，使真正意義上的早期診斷成為現實；（3）高通量、高效率，1～2h可全自動同步完成近百個樣品的擴增及檢測，且結果重現性好；（4）無須凝膠電泳，采用全封閉反應管及光電傳導系統，無管道內污染；（5）可對DNA、RNA的PCR產物進行定量分析。

河南省鄭州某養殖場2004年5月發生了以腹瀉和生長遲緩為主要癥狀的疑似IB疾病，感染雞主要表現精神沉郁，下痢，生長緩慢及抵抗力下降，發病率為100%，死亡率達10%?以上，感染雞群的生產性能顯著降低。調查中顯示，與雞舍相距僅150m左右處有一個1700只的肉鴨群，在第一批雞發病前約10天左右鴨群發生過類似癥狀的疾病，但沒有造成大量死亡。死亡雞病變主要為小腸出血，腸壁變薄，有的有潰蕩，小腸絨毛脫落,腺胃乳頭腫大、粘膜脫落，有的肌胃和腺胃交界處有出血，肌胃有出血或潰蕩，腎臟腫大，呈“花斑腎”，肺臟無明顯變化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎縮；病鴨剖檢以腎臟腫大，蒼白兼有出血、腿肌及肝臟出血為主要特征。在同地區的其他雞場也發生了同樣癥狀的疾病，雖然經過多種IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技學院動物科學學院開展了對該疫病的研究工作，結果從發病鴨體內分離到一株病毒，鑒定為IBV，命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株（保藏編號為?CGMCC?NO.3842），其專利文獻公開號為CN?101906404A，此為首次有關家鴨感染IBV的報道。本病毒分離株ZZ2004來自雞鴨混養的養殖場，其不僅引起雞的大批發病及死亡，還感染了鴨群，嚴重影響了家鴨的生長發育并導致鴨的死亡。與其它禽類的冠狀病毒相比，鴨源性冠狀病毒ZZ2004變異的程度較大，對動物的感染譜更廣，其對家禽養殖業的影響更加致命。因此，針對該病毒建立起快速、有效的檢測方法就尤為關鍵。但目前對于該病毒還缺乏有效的新型分子生物學檢測方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是一種針對鴨源性冠狀病毒ZZ2004毒株的熒光定量RT-PCR檢測引物及試劑盒，該試劑盒特異性強，靈敏度高，操作簡單，所需時間短，可以對大量的樣品進行檢測。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

一種熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物及探針，其核苷酸序列如下：

上游引物：5'-AGGTAGTGGTGTTCCTGATAATGAG-3’（26085-26109），

下游引物：5'-ACGCATCTGGGACTGGTTTTC-3'（26180-26200），

探針引物（P）：5'（FAM）-CCTGGCTTATACCTGGCTTGGCGTCT-（Eclipse）3'（26143-26168）。

與所述上、下游引物相對應的鴨源性冠狀病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；與所述探針引物相對應的鴨源性冠狀病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

所述上游引物和下游引物對鴨源性冠狀病毒ZZ2004株RT-PCR擴增出約117bp的產物。

上述熒光定量RT-PCR檢測引物及探針在對鴨源性冠狀病毒ZZ2004的鑒別和定量檢測中的應用。

一種熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，含有上述所有引物及探針。

以單樣份計量（即檢測一個禽只樣或待測樣的用量），上述熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒的RT-PCR反應體系中含有：