[發明專利]熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201110103579.0
• 申請日: 2011-04-25
• 公開（公告）號: CN102181583A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 劉興友;劉明成;王麗榮;胡建和
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

1.一種熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物及探針，其核苷酸序列如下：

上游引物：5'-AGGTAGTGGTGTTCCTGATAATGAG-3’，

下游引物：5'-ACGCATCTGGGACTGGTTTTC-3'，

探針引物：5'-CCTGGCTTATACCTGGCTTGGCGTCT-3'。

2.根據權利要求1所述的熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物及探針，其特征在于，與所述上、下游引物相對應的鴨源性冠狀病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；與所述探針引物相對應的鴨源性冠狀病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

3.根據權利要求1所述的熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物及探針，其特征在于，所述上游引物和下游引物對鴨源性冠狀病毒ZZ2004株RT-PCR擴增出約117bp的產物。

4.權利要求1所述的熒光定量RT-PCR檢測引物及探針在對鴨源性冠狀病毒ZZ2004的鑒別和定量檢測中的應用。

5.一種熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述的所有引物及探針。

6.根據權利要求5所述的熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，含有熒光定量RT-PCR反應體系，以單樣份計量，該熒光定量RT-PCR反應體系包括：

RNase?Free?ddH₂O?17.75μL、25μmol/L的dNTP?Mixture?1μL、10×PCR?Buffer?Mg²⁺?2.5μL、10μmol/L的上游引物F₃?0.25μL、10μmol/L的下游引物F₄0.25μL、10μmol/L的探針引物0.5μL、5U/μL的?rTaq?0.25μL，且檢測時使加入待測樣液后的RT-PCR反應體系總體積為25μL。

7.根據權利要求6所述的熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述待測樣液的制備方法如下：

（1）取相應的待檢組織器官，剪碎放入無菌離心管中，按1g：5mL的比例加入經高壓滅菌PBS緩沖液，?-20℃下反復凍融2～3次，1000rpm離心5～8min；棄沉淀，取上清于另一無菌離心管中，8000rpm離心8～12min；棄沉淀，取上清于另一無菌離心管中，12000rpm離心8～12min；棄沉淀，取上清于另一無菌離心管中，用0.22μm的濾器過濾，得濾液；

（2）用RNA提取試劑提取RNA，再進行一步法反轉錄反應，反應體系為：5×Buffer?2μL、?Enzzyme?Mix?0.5μL、Random?6?mers??0.5μL、Oligo?dT?primer?0.5μL、Totall?RNA?5μL、RNase?Free?ddH₂0?1.5μL，總體積為10μL，反應條件為：37℃、15min，85℃、5s。

8.根據權利要求6所述的熒光定量RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，以所述試劑盒對待測樣液進行TaqMan熒光定量RT-PCR擴增時的反應條件為：

94℃??30s，

94℃??10s????????????????????????????????????????????????????60℃??1min???????????40?cycle。