[發(fā)明專利]RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110103532.4
• 申請日: 2011-04-25
• 公開（公告）號: CN102140559A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉興友;劉明成;王麗榮;胡建和
• 申請（專利權(quán)）人: 河南科技學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具體涉及一種RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物及試劑盒。

背景技術(shù)

禽傳染性支氣管炎(IB)是由冠狀病毒科的禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種常見多發(fā)的急性高度接觸性傳染病，表現(xiàn)為呼吸型、腎型、腸型、腺胃型等多種病型。該病可感染所有日齡的雞，導(dǎo)致生長遲緩、死亡、增重和飼料報(bào)酬降低。IBV往往引起復(fù)合感染，如新城疫（Newcastle?Disease,?ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可繼發(fā)細(xì)菌性疾病，如大腸桿菌病、沙門氏菌病等，從而加重了對雞群的危害。據(jù)《世界家禽》1999年資料，全世界的禽病中，以呼吸系統(tǒng)疾病最為嚴(yán)重，其中IB是世界大多數(shù)地區(qū)危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病。1988年以來，IB在我國大部分地區(qū)相繼流行，疫區(qū)的發(fā)病率可達(dá)100％，死亡率可達(dá)10～30％。由于雞傳染性支氣管炎的血清亞型眾多，病毒的變異性強(qiáng)，給臨床診斷和防制帶來了重重困難。常規(guī)的病毒分離鑒定、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等檢測手段費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且敏感性不強(qiáng)，無法滿足需要。因此建立快速而又有效地檢測方法就尤為關(guān)鍵。

2004年5月，河南省鄭州某養(yǎng)殖場發(fā)生了以腹瀉和生長遲緩為主要癥狀的疑似IB疾病，感染雞主要表現(xiàn)精神沉郁，下痢，生長緩慢及抵抗力下降，發(fā)病率為100%，死亡率達(dá)10%?以上，感染雞群的生產(chǎn)性能顯著降低。調(diào)查中顯示，與雞舍相距僅150m左右處有一個(gè)1700只的肉鴨群，在第一批雞發(fā)病前約10天左右鴨群發(fā)生過類似癥狀的疾病，但沒有造成大量死亡。死亡雞病變主要為小腸出血，腸壁變薄，有的有潰蕩，小腸絨毛脫落,腺胃乳頭腫大、粘膜脫落，有的肌胃和腺胃交界處有出血，肌胃有出血或潰蕩，腎臟腫大，呈“花斑腎”，肺臟無明顯變化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎縮；病鴨剖檢以腎臟腫大，蒼白兼有出血、腿肌及肝臟出血為主要特征。在同地區(qū)的其他雞場也發(fā)生了同樣癥狀的疾病，雖然經(jīng)過多種IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院開展了對該疫病的研究工作，結(jié)果從發(fā)病鴨體內(nèi)分離到一株病毒，鑒定為IBV，命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株（保藏編號為?CGMCC?NO.3842），其專利文獻(xiàn)公開號為CN?101906404A，此為首次有關(guān)家鴨感染IBV的報(bào)道。該病毒分離株ZZ2004來自雞鴨混養(yǎng)的養(yǎng)殖場，其不僅引起雞的大批發(fā)病及死亡，還感染了鴨群，嚴(yán)重影響了家鴨的生長發(fā)育并導(dǎo)致鴨的死亡。與其它禽類的冠狀病毒相比，鴨源性冠狀病毒ZZ2004變異的程度較大，對動(dòng)物的感染譜更廣。對于該病毒，目前還缺乏快速有效的分子生物學(xué)檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是一種針對鴨源性冠狀病毒ZZ2004毒株的RT-PCR檢測引物及試劑盒，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡單，所需時(shí)間短，可以對大量的樣品進(jìn)行檢測。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5'-GTTGTGGATGCTTTGGTATC-3’（23749-23768），如SEQ?ID?NO:2所示，

下游引物：5'-GCTACAAACCCACAAAAGAC-3’（24269-24288），如SEQ?ID?NO:3所示。

與所述RT-PCR檢測引物相對應(yīng)的鴨源性冠狀病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

所述上游引物和下游引物對鴨源性冠狀病毒ZZ2004株RT-PCR擴(kuò)增出約540bp的產(chǎn)物。

上述RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物在對鴨源性冠狀病毒ZZ2004的鑒別和檢測中的應(yīng)用。

一種RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，含有上述的所有引物。

以單樣份計(jì)量（即檢測一個(gè)禽只樣或待測樣的用量），上述RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒的RT-PCR反應(yīng)體系中含有：

ddH₂O?18.25μL、40μmol/L的dNTP?Mixture?1μL、10×PCR?Buffer?(Mg²⁺)?2.5μL、2.5pmol/L的上游引物F₁0.25μL、2.5pmol/L的下游引物F_2?0.25μL、5U/μL?rTaq?0.25μL，且檢測時(shí)使加入待測樣液后的RT-PCR反應(yīng)體系總體積為25μL。

所述待測樣液的制備方法如下：