[發明專利]RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物及試劑盒

無效

• 申請號: 201110103532.4
• 申請日: 2011-04-25
• 公開（公告）號: CN102140559A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 劉興友;劉明成;王麗榮;胡建和
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

1.一種RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5'-GTTGTGGATGCTTTGGTATC-3’，

下游引物：5'-GCTACAAACCCACAAAAGAC-3’。

2.根據權利要求1所述的RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物，其特征在于，與所述RT-PCR檢測引物相對應的鴨源性冠狀病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

3.根據權利要求1所述的RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物，其特征在于，所述上游引物和下游引物對鴨源性冠狀病毒ZZ2004株RT-PCR擴增出約540bp的產物。

4.權利要求1所述的RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的引物在對鴨源性冠狀病毒ZZ2004的鑒別和檢測中的應用。

5.一種RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述的所有引物。

6.根據權利要求5所述的RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，含有RT-PCR反應體系，以單樣份計量，該RT-PCR反應體系包括：

ddH₂O?18.25μL、40μmol/L的dNTP?Mixture?1μL、10×PCR?Buffer?Mg²⁺??2.5μL、2.5pmol/L的上游引物F₁?0.25μL、2.5pmol/L的下游引物F_2?0.25μL、5U/μL?rTaq?0.25μL，且檢測時使加入待測樣液后的RT-PCR反應體系總體積為25μL。

7.根據權利要求6所述的RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述待測樣液的制備方法如下：

（1）待測樣品處理：取相應的組織器官，剪碎放入無菌離心管中，按1g：5mL的比例加入經高壓滅菌PBS緩沖液，-20℃下反復凍融2～3次，1000rpm離心5～8min；棄沉淀，取上清于另一支無菌離心管中，8000rpm離心8～12min；棄沉淀，取上清于另一無菌離心管中，12000rpm離心8～12min；棄沉淀，取上清于另一無菌離心管中，用0.22μm的濾器過濾，得濾液；

（2）RNA的提取：用RNA提取試劑取待測樣品的RNA，再進行一步法反轉錄反應，反轉錄第一步，dNTP?Mixture?1μL、下游引物1μL、上步所得Template?RNA8μL瞬間離心混合均勻，反應條件為65℃?5min，4℃下保存；反轉錄第二步，上述變性退火反應液10μL、5×PrimeScript^TM?Buffer?4μL、40Ｕ/μL??RNase?Inhibitor?0.5μL、PrimeScript^TM?RTase??for?2?step??0.5μL、RNase?Free?ddH₂O?5μL瞬間離心混合均勻，反應條件為?30℃、10min，42℃、30min，95℃?5min，4℃保存。

8.根據權利要求6所述的RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，以所述試劑盒對待測樣液進行熱蓋方式RT-PCR擴增時的反應條件為：瞬間離心混合均勻，95?℃、3min，（95℃、1min；57℃、1min，72℃、1min，35cycle.），2℃?10min，4℃、pause。

9.根據權利要求8所述的RT-PCR檢測鴨源性冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR擴增后所得PCR產物在通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結束后用凝膠成像系統分析，在540bp處出現特異條帶，說明樣品帶鴨源性冠狀病毒ZZ2004，反之，則不攜帶該鴨源性冠狀病毒ZZ2004。