[發明專利]一種聚乙二醇化的葡激酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110102611.3
• 申請日: 2011-04-22
• 公開（公告）號: CN102212512A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 賀進田;劉建偉;王改珍
• 申請（專利權）人: 河北師范大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/63;C12N1/21;A61K38/49;A61K47/48;A61P7/02
• 代理公司: 石家莊新世紀專利商標事務所有限公司 13100
• 代理人: 董金國

技術領域

本發明涉及一種聚乙二醇化的葡激酶突變體及其制備方法和應用，屬于生命科學技術領域。

背景技術

天然葡激酶(staphylokinase，Sak)是來源于金黃色葡萄球菌的一種蛋白質，由136個氨基酸組成。Sak是一“間接型”纖溶酶原激活劑，它不能直接使纖溶酶原(Plg)轉變為纖溶酶(plasmin，Plm)，而是先與纖溶酶原按1∶1比例結合形成無活性的復合物Sak·plg，在少量纖溶酶啟動下，纖溶酶原活性部位暴露，由單鏈變為雙鏈的纖溶酶，形成活性Sak·plm復合物，后者進一步激活纖溶酶原分子，使之轉變為纖溶酶，纖溶酶溶解血栓基質纖維蛋白從而溶解血栓。在血漿中，Sak·plm很快被α2-抗纖溶酶抑制，不激活纖溶系統；有血栓存在時Sak·plm復合物與血栓中的纖維蛋白結合，α2-抗纖溶酶對Sak·plm復合物的抑制速度會下降100倍。臨床研究結果表明，它與美國治療急性心肌梗塞的標準溶栓藥物阿特普酶有等同的溶栓療效，且葡激酶激活纖溶酶原的纖維蛋白特異性更強(Collen?D.et?al.Nature?Medicine.4.279-284(1998))。

盡管葡激酶在臨床上表現出諸多優點，但是它還存在明顯的缺點。葡激酶是異體蛋白，在人體內會產生免疫反應，產生高滴度的中和抗體，甚至會發生超敏反應。因此，降低葡激酶的免疫原性，已經成為將其廣泛應用于臨床亟待解決的問題。研究表明，Sak存在三個互不重疊的B細胞抗原決定簇，抗原表位1包括K74，E75，R77，抗原表位3包括K35，E38，E80，D82，抗原表位2尚無具體定位，可能包括一些與二聚體形成相關的氨基酸。Petra?A.M.等對SakSTAR的T細胞表位進行了分析，篩選得到了6個不同的免疫原性區域，其中Sak的71-87氨基酸序列(C3區)可刺激90％的T淋巴細胞克隆的特異性增殖(Warmerdam?P.A.，et?al.J.Immunol.，2002，168：155-161)。進一步研究發現C3區肽段包含S1(72-82)和S2(75-85)二個重疊的T細胞表位序列，其中Y73、F76位氨基酸分別為兩個表位的關鍵氨基酸，將它們替換為A，則肽段S1、S2與HLA-DR的結合能力下降。以上研究結果表明，C3區段是B細胞抗原表位和T細胞抗原表位非常集中的區域。對蛋白質的關鍵性抗原表位進行聚乙二醇定點修飾，既可以去除B細胞抗原表位，也可以去除T細胞抗原表位，可以顯著降低蛋白質的免疫原性，并且可以延長蛋白質藥物的體內半衰期。

發明內容

本發明的目的是提供一種聚乙二醇化葡激酶突變體及其制備方法。

本發明的目的還在于提供一種所述聚乙二醇化葡激酶突變體作為血栓栓塞性疾病溶栓治療藥物的應用。

本發明的構思是這樣的：本發明選擇葡激酶71-87位氨基酸序列之中的任一親水性氨基酸進行定點突變，將其替換為半胱氨酸(簡寫為C)，然后使用甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對此半胱氨酸進行定點修飾，希望對該位點進行的聚乙二醇修飾能夠綜合破壞這個區段內的T、B細胞表位，所構建的聚乙二醇化葡激酶突變體的免疫原性大大降低，并延長其在體內的血漿半衰期，同時保留其溶解血栓的纖溶活性。所選擇的突變氨基酸包括第74位賴氨酸(簡寫為K74)、第75位的谷氨酸(簡寫為E75)、第77位精氨酸(簡寫為R77)、第80位的谷氨酸(簡寫為E80)和第82位天冬氨酸(簡寫為D82)。

具體地，本發明設計的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SP5)是將野生型Sak的K74替換為半胱氨酸(簡寫為C)后，再用分子量為5000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇(簡寫為P5)對葡激酶突變體Sak(K74C)中的半胱氨酸進行定點修飾，經純化后得到的產物，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價鍵相連。

本發明設計的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E75C-SP5)是將野生型Sak的E75替換為半胱氨酸(簡寫為C)后，再用分子量為5000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇(簡寫為P5)對葡激酶突變體Sak(E75C)中的半胱氨酸進行定點修飾，經純化后得到的產物，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價鍵相連。