[發明專利]一種聚乙二醇化的葡激酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110102611.3
• 申請日: 2011-04-22
• 公開（公告）號: CN102212512A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 賀進田;劉建偉;王改珍
• 申請（專利權）人: 河北師范大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/63;C12N1/21;A61K38/49;A61K47/48;A61P7/02
• 代理公司: 石家莊新世紀專利商標事務所有限公司 13100
• 代理人: 董金國

1.一種聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于：是將野生型葡激酶的71-87氨基酸序列之中的任一親水性氨基酸進行定點突變，將其替換為半胱氨酸，通過構建重組表達質粒，得到葡激酶突變體，然后使用甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對葡激酶突變體中的半胱氨酸進行定點修飾，得到的聚乙二醇化葡激酶突變體。

2.根據權利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SP5)是將野生型Sak的K74替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為5000。

3.根據權利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E75C-SP5)是將野生型Sak的E75替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為5000。

4.根據權利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(R77C-SP5)是將野生型Sak的R77替換為半胱氨酸(簡寫為C)，突變體中半胱氨酸的側鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為5000。

5.根據權利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)是將野生型Sak的E80替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量分別為5000和10000。

6.根據權利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(D82C-SP5)是將野生型Sak的D82替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為5000。

7.一種聚乙二醇化葡激酶突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)以野生型Sak的表達質粒pBV-Sak為模板，使用突變引物進行PCR擴增，直接得到表達質粒，并轉化感受態大腸桿菌DH5α，轉化產物涂布在含氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗證是否發生預計位置的突變；

(2)Sak突變體的表達質粒轉化大腸桿菌得到各個突變體的工程菌，通過升高培養溫度誘導Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)基因的表達，表達產物以胞內可溶性蛋白的形式存在；

(3)發酵技術：以M₉CA培養基培養Sak突變體工程菌，pH＝6.5-7.5，溫度37℃時，培養菌體，在42℃時誘導表達目的蛋白；

(4)Sak突變體工程菌發酵后，離心收集菌體，重懸后超聲破碎菌體，離心并收集上清液，用色譜法純化產品，色譜方法的順序為陽離子交換色譜、凝膠過濾色譜和陰離子交換色譜，得到高純度的葡激酶突變體Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)；

(5)所得到的葡激酶突變體Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)與過量的二硫蘇糖醇反應后，Sephadex?G-50層析柱除去未反應的二硫蘇糖醇，然后，葡激酶突變體Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)與分子量為5000或10000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇室溫下反應，用色譜法純化產品，色譜方法的順序為陽離子交換色譜、凝膠過濾色譜，得到高純度的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)、Sak(D82C-SP5)。

8.一種如權利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體的應用，其特征在于作為血栓栓塞性疾病的溶栓治療藥物應用。