[發明專利]雙溫快循環熒光定量PCR端粒酶活性的檢測方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201110101394.6
• 申請日: 2011-04-22
• 公開（公告）號: CN102220418A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 黃艷萍;劉照勝;湯華
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/25
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術領域

本發明涉及一種雙溫快循環熒光定量PCR端粒酶活性的檢測方法和試劑盒。該方法應用錨定發夾引物(Anchored?hairpin?structural?primer，AHP)及復合式蝎形引物(Duplex?scorpion?primer，DS)，在熒光定量PCR儀上，采用雙溫快循環PCR擴增條件，進行端粒酶活性的檢測。即為用DS/AHP-TRAP(錨定發夾引物及復合式蝎形引物-端粒重復序列擴增分析法)檢測端粒酶活性的試劑盒。

背景技術

端粒酶(Telomerase)是廣譜腫瘤標志物，它在近90％的癌癥中都有高頻率的表達，而良性、癌前病變以及癌周圍的組織中，一般無表達。端粒酶活性的測定具有直接性、高敏感性和強特異性，可作為一個獨立的惡性腫瘤早期診斷、治療監測和預后判斷的指標。而且作為分子診斷手段，端粒酶活性檢測明顯優于腫瘤臨床病理分期、組織學分型或細胞分化程度等現有細胞學診斷技術。它尤其對篩查或診斷無癥狀的早期癌癥，具有特殊的價值；對于那些形態學上良惡性難以鑒別的腫瘤，是判斷腫瘤惡性程度有用的指標；作為肝細胞癌切除術后復發的獨立預測指標，可預測肝癌術后轉移復發。另一方面，端粒酶也是腫瘤治療的最佳靶點之一，由于端粒酶在腫瘤細胞與正常體細胞之間的差別，端粒酶抑制劑可減少對機體的毒副作用。因此，抗端粒酶療法已成為腫瘤治療的一種新方法。圍繞端粒酶抑制劑的研究也在如火如荼地進行著，而端粒酶活性測定則是評價藥物的重要指標。總之，端粒酶活性的測定可用于癌癥早期診斷、癌癥預后、癌癥的基因治療和抗癌藥物研發等各個領域。因此，采用現代分子生物學技術，研究開發端粒酶活性檢測的新方法，為腫瘤防治提供技術上的保障，加速臨床應用的進程，是十分必要的。

檢測端粒酶活性的標準方法是端粒重復序列擴增分析法(telomeric?repeat?amplification?protocol，TRAP，Kim?N.W.，Piatyszek?M.A.，Prowse?K.R.，Harley?C.B.，West?M.D.，Ho?P.L.C.，Coviello?G.M.，Wright?W.E.，Weinrich?S.L.，Shay?J.W.，Science，1994，266，2011-2015)。該法主要分為三個步驟：1)延伸階段，底物在端粒酶的作用下延伸，其3′-端加入若干TTAGGG的重復序列；2)PCR擴增階段，端粒酶延伸產物擴增數百萬倍以上；3)產物的檢測階段。TRAP法巧妙地將PCR技術應用于端粒酶活性檢測中，極大地提高了檢測的靈敏度，

與常規的PCR擴增不同，TRAP方法檢測的不是樣本中核酸的量，而是端粒酶活性。因此在PCR擴增之前，端粒酶首先對底物進行延伸，產生端粒酶延伸產物，隨后通過對端粒酶延伸產物的擴增，達到檢測端粒酶活性的目的。TRAP法的模板分子——端粒酶延伸產物序列很特殊，由底物序列和多個不等的端粒重復序列組成。因此，在以底物序列為正向引物的TRAP法中，反向引物CX設計為有三個錯配堿基的端粒重復序列的互補序列。然而由于端粒酶延伸產物含有多個端粒重復序列，因此，在PCR反應的每一輪循環時，它仍可結合在端粒重復序列的任意部位，甚至在同一時間同一條模板分子上都可能會有多于一個的CX引物開始延伸。這導致了TRAP法得到的PCR產物的個數與端粒酶延伸產物不完全一致。從而干擾檢測結果。

改進PCR反向引物的新方法，如CX-ext、CXa引物、錨定引物ACX、發夾型引物以及雙反向引物-TRAP法等，均極大地減少了副產物的生成。其中錨定引物在5′-末端加入了一段與端粒序列無關的錨定序列，使得PCR產物5′-末端被非端粒序列封閉，阻止端粒酶產物在此端的延伸。從而避免了假陽性結果的出現，因而得到廣泛的應用。但是該方法在不進行熱啟動時，會有非特異性產物生成。除此之外，TRAP法尚有許多常規PCR的不足之處，如終點檢測結果，因此，勞動強度大、定量不準確、重現性差；同時，在測定PCR擴增產物前須打開反應管，易造成污染。因此，難以滿足臨床應用的要求。

熒光定量PCR技術巧妙地將PCR擴增、熒光探針雜交和光學檢測結合于一體，通過微機控制，對PCR每一輪循環進行實時監測，并自動報告分析結果。該技術操作簡單、安全、自動化程度高。不需要PCR后處理，從而從根本上解決了產物污染而導致的假陽性問題。而且特異性、靈敏度和重現性顯著提高。同時，由于在PCR擴增的指數期(原始模板以相對固定的指數形式增長)進行定量檢測，從而真正在技術上實現了PCR從定性到定量的飛躍。