[發(fā)明專利]雙溫快循環(huán)熒光定量PCR端粒酶活性的檢測(cè)方法和試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110101394.6
• 申請(qǐng)日: 2011-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN102220418A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃艷萍;劉照勝;湯華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/25
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

1.一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于它包括如下步驟：

1)永生化細(xì)胞蛋白提取液及人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物定量標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備；

2)在熒光定量PCR儀上，將新型錨式發(fā)夾型引物與復(fù)合式蝎形引物結(jié)合，組成一個(gè)新的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增分析法體系，在雙溫快循環(huán)PCR擴(kuò)增條件下，完成對(duì)細(xì)胞樣品中端粒酶活性及標(biāo)準(zhǔn)溶液中端粒酶延伸產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)；

3)根據(jù)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，得到兩組定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即檢測(cè)端粒酶活性定量曲線和端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線，在這兩組定量標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合圖上，得到以人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物的總量，即TPG值表示細(xì)胞中端粒酶活性的定量方法。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的錨定發(fā)夾型引物為：

5′-GCGC?GGTTAGGG?CTTACCCTTACCCTTA?CCCTAACC-3′

其中，下劃線部分為發(fā)夾的莖部，中間未劃線部分為與靶序列互補(bǔ)的引物序列，5′-端的未劃線部分為錨定序列；

復(fù)合式蝎形引物為引物探針，包括探針引物和猝滅探針兩部分，序列分別為：

PP：FAM-5′-[CCCTAA]₃-阻斷劑-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；阻斷劑為三個(gè)碳原子的碳鏈，帶下劃線的為探針序列

QP：5′[TTAGGG]₃-3′-DABCYL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的雙溫快循環(huán)PCR擴(kuò)增條件為：94℃0s，45℃3s，樣品中端粒酶活性的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)可在30個(gè)循環(huán)數(shù)內(nèi)完成。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物為含有6個(gè)端粒重復(fù)序列的端粒酶延伸產(chǎn)物R6，即：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₆-3′。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的用TPG值表示細(xì)胞中端粒酶的活性，是根據(jù)假設(shè)1個(gè)TPG為1個(gè)永生化細(xì)胞產(chǎn)生的端粒酶延伸產(chǎn)物，確定TPG代表的定量標(biāo)準(zhǔn)物R6的量，即一個(gè)TPG為0.0058amol的R6時(shí)，一個(gè)TPG相當(dāng)于一個(gè)永生化細(xì)胞。

6.一種雙溫快循環(huán)熒光定量PCR快速檢測(cè)端粒酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟：

1)樣品的制備：a)永生化細(xì)胞蛋白提取液：10，10²，10³，10⁴/μL的永生化細(xì)胞樣品；b)陰性對(duì)照樣品；c)人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6標(biāo)準(zhǔn)溶液：3300，330，33，3.3，0.33，0.033amol/μL的R6_(1-6)標(biāo)準(zhǔn)溶液；

2)反應(yīng)液的制備：1×TRAP緩沖液，1.5mmol/L?MgCl₂，各50μmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.21μmol/L的AHP，2U?Taq?DNA聚合酶，0.5μmol/L的PP鏈及1.0μmol/L的QP鏈，2μL樣品溶液，反應(yīng)液總體積為25μL；反應(yīng)條件：采用30℃下30min進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng)，隨后采用94℃0s，45℃3s的雙溫快循環(huán)的方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

3)測(cè)定：a)永生化細(xì)胞蛋白提取液實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的測(cè)定；b)試劑盒定量工作曲線的確定：將人工合成端粒酶延伸產(chǎn)物R6_(1-6)標(biāo)準(zhǔn)溶液及一系列細(xì)胞樣品及按以上條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到兩組擴(kuò)增曲線；

4)數(shù)據(jù)處理：a)永生化細(xì)胞蛋白提取液工作曲線：在細(xì)胞樣品擴(kuò)增曲線上設(shè)定熒光閾值，得到不同樣品的Ct值；繪制細(xì)胞拷貝數(shù)10⁴～10的范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；b)試劑盒定量工作曲線及TPG值的確定：同法繪制定量標(biāo)準(zhǔn)品R6的工作曲線，并與永生化細(xì)胞定量標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。從端粒酶活性定量曲線及端粒酶延伸產(chǎn)物定量曲線的吻合圖上，得到以TPG值表示細(xì)胞中端粒酶的活性的定量方法。

7.一種權(quán)利要求1所述的雙溫快循環(huán)熒光定量PCR檢測(cè)端粒酶活性的試劑盒，其特征在于它包括：

洗液：Hepes-KOH?10mmol/L?pH?7.5，MgCl₂?1.5mmol/L，KCl?10mmol/L，DTT?1mmol/L；

細(xì)胞裂解液：Tris-HCl?10mmol/L?pH?7.5，EGTA?1mmol/L，MgCl₂?1mmol/L，β-巰基乙醇5mmol/L，甘油10％，CHAPS?0.5％，PMSF?0.1mmol/L；

10×TRAP緩沖液：Tris-HCl?200mmol/L?pH＝8.3，10mmol/L?EGTA，630mmol/L?KCl，0.05％Tween-20，1mg/mL?BSA；

復(fù)合式蝎形引物PP：FAM-5′-[CCCTAA]₃-阻斷劑-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′

PP+QP：阻斷劑為三個(gè)碳原子的碳鏈，帶下劃線的為探針序列，

QP：5′[TTAGGG]₃-3′-DABCYL；

定量標(biāo)準(zhǔn)物R6：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₆-3′；

AHP：5′-GCGC?GGTTAGGG?CTTACCCTTACCCTTA?CCCTAACC-3′；

附：25mmol/L?MgCl₂，2.5mmol/L?dNTP含dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5mmol/L，5U/ul?Taq?DNA聚合酶。