[發明專利]過濾染色計數細胞的方法及裝置

有效

• 申請號: 201110100618.1
• 申請日: 2011-04-21
• 公開（公告）號: CN102288531A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 李京寶;商澎;李亞楠;騫愛榮
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 西北工業大學專利中心 61204
• 代理人: 顧潮琪

技術領域

本發明涉及一種測量方法及裝置，具體地說，是關于細胞計數的方法及裝置。

背景技術

細胞計數是在生命科學研究，尤其是在細胞培養相關實驗和生產中經常使用的技術。現有細胞計數方法各有局限：經典的血球計數板法及其系列衍生方法(如申請號為01213605.0的中國專利所述細胞計數方法)雖然測量直觀，但由于細胞分散不利或檢測人員的熟練程度等原因會產生計數誤差，且單個樣本計數耗時較長，無法同時對大量樣本進行操作，降低了實驗結果的平行性；染色法雖然可以滿足批量操作的要求，但是往往僅適用于貼壁生長的細胞(如日本專利WO2006003696)，對于懸浮生長的細胞還需若干操作才能完成，從而影響了計數的批處理程度，降低了計數的準確性。

發明內容

為了克服現有技術計數準確度不高、不易于實現自動化的缺點，本發明提供了一種操作簡單，主觀度數因素少，易于實現自動化批處理的細胞計數方法。

本發明所采用的技術方案步驟包括以下步驟：

1.準備好需要計數的未知數量的實驗組細胞和至少4組已知數量的標準組細胞懸液，所述細胞懸液可由懸浮生長細胞直接使用，或貼壁細胞經過消化步驟形成，各組細胞懸液的體積相同；

2.每個細胞懸液樣品對應一個過濾裝置，分別將各組細胞懸液通過過濾裝置，使細胞截留在濾膜之上；

3.分別使用細胞懸液2倍以上體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗截留在過濾裝置上的細胞；

4.分別加入細胞懸液1倍以上體積的濃度為0.1％～1％的結晶紫溶液于過濾裝置中浸泡細胞10分鐘～1小時；

5.分別吸去結晶紫溶液，用細胞懸液5倍以上體積PBS清洗過濾裝置中的細胞；

6.分別排出過濾裝置中殘存液體；

7.分別用細胞懸液1倍以上體積的濃度為3％～30％的醋酸溶液沖洗過濾裝置，收集濾液；

8.分別將所得濾液經稀釋3倍體積以上后，使用可見分光光度計，測量570nm波長處光密度；

9.結合標準組已知細胞數量與光密度繪制標準曲線，得到光密度I_標準與細胞數量N_標準的關系公式：I_標準＝a×N_標準+b，其中a為一元線性相關系數，b為截距，皆通過標準曲線計算得知；

10.根據標準曲線和實驗組細胞樣品的光密度計算實驗組細胞數量，即N_實驗＝(I_實驗-b)/a。

所述的結晶紫溶液采用水、生理鹽水或PBS緩沖液作為溶劑配制。

本發明還提供一種用于過濾染色計數細胞方法的裝置，包括洗滌液容器、染色液容器、脫色液容器、廢液容器、過濾裝置、泵系統、比色裝置、三通閥和計算機。實驗組及標準組細胞懸液通過三通閥分別與洗滌液容器、染色液容器相連通，之后通過三通閥與脫色液容器相連通至過濾裝置，過濾裝置的輸出口通過泵系統與比色裝置相連，比色裝置將測量數據反饋于計算機。待檢測完成后，由和比色裝置相連的導管將廢液排除到廢液容器中。在上述各個環節中，由計算機控制各個三通閥、泵系統以及比色裝置工作。

本發明的有益效果是：由于采用過濾裝置對細胞懸液進行過濾，截留細胞，已過濾裝置中的濾膜作為固相支持載體，對其上細胞進行染色、沖洗、脫色等處理，最終利用結晶紫洗脫液的光密度來計算細胞數量。與現有技術相比，本發明體現了減少主觀度數因素對結果的影響，易于實現自動化批處理，以提高測定精度及結果平行性的有益效果。

下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。

附圖說明

圖1是本發明的方法流程圖；

圖2是本發明的裝置示意圖；

圖中，1-實驗組及標準組細胞懸液，2-洗滌液容器，3-染色液容器，4-脫色液容器，5-過濾裝置，6-泵系統，7-比色裝置，8-廢液容器，9-計算機，10-三通閥b，11-三通閥a，12-三通閥c。

具體實施方式

方法實施例1：使用本發明所述方法進行人白血病細胞系K562細胞計數

1、準備人白血病細胞系K562以未知密度(實驗組)及已知密度(標準組)每毫升8×10⁵、4×10⁵、2×10⁵、1×10⁵、0.5×10⁵、0.25×10⁵個細胞；

2、將0.2毫升的各組樣品混勻后分別注入過濾裝置5，使細胞截留于過濾裝置5之上；