[發明專利]一種神經干細胞凍存復蘇的方法

有效

• 申請號: 201110096959.6
• 申請日: 2011-04-18
• 公開（公告）號: CN102228016A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 金宜強;姚靜;楊立敏
• 申請（專利權）人: 上海安集協康生物技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0797
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 封新琴;張紅春

技術領域

本發明涉及生物制品領域，具體涉及一種神經干細胞凍存復蘇的方法。本發明通過添加EGF和bFGF兩種細胞因子，使得神經干細胞凍存復蘇率大大提高，由現有技術中的40％左右達到90％以上，本發明對神經干細胞成功地進行了凍存、復蘇，對臨床擇期進行干細胞移植手術和建立“干細胞庫”具有重要的意義。

背景技術

神經干細胞(Neural?Stem?Cell，NSC)是存在于胚胎或成體腦、脊髓等組織中的一種干細胞，是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，可通過不對等的分裂方式分化成神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等神經組織的各類細胞，也可轉分化成血細胞和骨骼肌細胞。在腦、脊髓等所有神經組織中，不同的神經干細胞類型產生的子代細胞種類不同，分布也不同。目前的科學技術已經可以在體外培養擴增神經干細胞，用于生命科學研究、藥物篩選測試、臨床應用研究等領域。由于神經干細胞凍存后復蘇率直接影響著神經干細胞的質和量，為獲得來源方便的神經干細胞，改進神經干細胞凍存復蘇技術、建立一種能夠長期儲存干細胞的方法對促進神經干細胞的研究和應用具有重要意義。

目前，神經干細胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復雜、質量不穩定、價格昂貴等缺點，無血清凍存和復蘇技術成為發展趨勢。目前神經干細胞無血清凍存液的主要成分是70％的無血清培養基、20％牛血清白蛋白(BSA)和10％二甲基亞砜(DMSO)。

凍存程序一般是梯度降溫的方法，降溫速度大約是1℃/分鐘。

對凍存的細胞進行復蘇時，一般是將凍存管直接置于37℃迅速解凍，然后加入完全生長培養基重懸細胞，離心棄上清后，再加入完全生長培養基繼續培養，以供后續的研究或測試使用。

結合上述無血清凍存和復蘇技術對神經干細胞進行凍存和復蘇，凍存后復蘇率僅有40％左右，遠低于含血清的凍存技術。

因此，本領域需要新的對神經干細胞進行凍存和復蘇的方法，以提高神經干細胞的凍存復蘇率，從而獲得優質的神經干細胞凍存復蘇產品，為以后神經干細胞移植手術和建立“干細胞庫”等應用奠定良好的基礎。

發明內容

本發明涉及一種神經干細胞凍存復蘇的方法，該方法對凍存液、復蘇液、凍存程序、復蘇程序等進行了改進和優化，使神經干細胞的復蘇率相對于現有技術的方法大大提高，從現有技術所獲得的40％左右的復蘇率提高到90％以上。

具體地，本發明的神經干細胞凍存復蘇方法包括以下步驟：凍存步驟、復蘇步驟和洗滌步驟，其中凍存步驟包括向神經干細胞懸液中加入凍存液和在液氮中凍存的步驟；復蘇步驟包括向從液氮中取出的凍存細胞中加入復蘇液使細胞復蘇的步驟；洗滌步驟包括將復蘇的細胞液洗滌后制備成細胞懸液備用。

本發明在傳統的凍存液配方中添加了生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。所述EGF在凍存液中的終濃度為0.008-0.04μg/ml、優選0.009-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml；所述bEGF在凍存液中的終濃度為0.008-0.04μg/ml、優選0.009-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml。

在一個具體實施方案中，所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含：1×B27添加劑，1×N2添加劑，L-谷氨酰胺，終濃度為1.6-2.4mM，丙酮酸鈉，終濃度為0.8-1.2mM，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，終濃度0.8-1.2mM，EGF(表皮生長因子)，終濃度0.005-0.04μg/ml、優選0.008-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，終濃度0.005-0.04μg/ml、優選0.008-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml，二甲基亞砜(DMSO)，終濃度7-8％(v/v)，牛血清白蛋白(BSA)，終濃度0.08-0.12g/ml。上述DMEM培養液、DMEM/F12培養液、B27添加劑和N2添加劑是培養神經干細胞的常用公知添加劑，購自Invitrogen公司，它們也可以從其它商業渠道購買得到。在配制過程中，將上述B27添加劑(Invitrogen，50倍濃度(50×))、N2添加劑(Invitrogen，100倍濃度(100×))加入DMEM或DMEM/F12培養液(Invitrogen，1倍濃度(1×))中，使B27添加劑、N2添加劑的終濃度分別為0.8×-1.2×濃度，優選Invitrogen公司建議使用的1倍濃度B27添加劑(1×B27添加劑)終濃度和1倍濃度N2添加劑(1×N2添加劑)終濃度。