[發明專利]一種神經干細胞凍存復蘇的方法

有效

• 申請號: 201110096959.6
• 申請日: 2011-04-18
• 公開（公告）號: CN102228016A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 金宜強;姚靜;楊立敏
• 申請（專利權）人: 上海安集協康生物技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0797
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 封新琴;張紅春

1.一種神經干細胞凍存復蘇的方法，包括以下步驟：

1)凍存步驟：包括向神經干細胞懸液中加入凍存液和在液氮中凍存的步驟；

2)復蘇步驟：包括向從液氮中取出的凍存細胞中加入復蘇液使細胞復蘇的步驟；

3)將復蘇的細胞液洗滌后制備成細胞懸液備用。

2.權利要求1的方法，其中所述凍存液包含表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。

3.權利要求2的方法，其中所述EGF在凍存液中的終濃度為0.005-0.04μg/ml、優選0.008-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml。

4.權利要求2的方法，其中所述bFGF在凍存液中的終濃度為0.005-0.04μg/ml、優選0.008-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml。

5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述凍存步驟包括將加入凍存液的神經干細胞懸液低溫，優選在-15℃至-25℃，更優選在-18℃至-22℃，最優選在-20℃放置一段時間，然后在-65℃至-75℃，優選在-68℃至-72℃，最優選在-70℃放置12-16個小時，再轉入液氮中凍存。

6.權利要求1-5任一項的方法，其中所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含：

1×B27添加劑，

1×N2添加劑，

L-谷氨酰胺，終濃度為1.6-2.4mM

丙酮酸鈉，終濃度為0.8-1.2mM

N-乙酰半胱氨酸(NAC)，終濃度0.8-1.2mM

EGF，終濃度0.005-0.04μg/ml、優選0.008-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml

bFGF，終濃度0.005-0.04μg/ml、優選0.008-0.03μg/ml，最優選0.01-0.02μg/ml

二甲基亞砜(DMSO)，終濃度7-8％(v/v)

牛血清白蛋白(BSA)，終濃度0.08-0.12g/ml。

7.權利要求6的方法，其中所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含：

1×B27添加劑，

1×N2添加劑，

L-谷氨酰胺，終濃度為2.0mM

丙酮酸鈉，終濃度為1.0mM

NAC，終濃度1.0mM

EGF，終濃度0.01μg/ml

bFGF，終濃度0.01μg/ml

DMSO，終濃度7.5％(v/v)

BSA，終濃度0.1g/ml。

8.權利要求6的方法，其中所述凍存液為DMEM或DMEM/F?12培養液中包含：

1×B27添加劑，

1×N2添加劑，

L-谷氨酰胺，終濃度為2.0mM

丙酮酸鈉，終濃度為1.0mM

NAC，終濃度1.0mM

EGF，終濃度0.02μg/ml

bFGF，終濃度0.02μg/ml

DMSO，終濃度7.5％(v/v)

BSA，終濃度0.1g/ml。

9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述復蘇液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含：

1×B27添加劑，

1×N2添加劑，

L-谷氨酰胺，終濃度為1.6-2.4mM

丙酮酸鈉，終濃度為0.8-1.2mM

NAC，終濃度0.8-1.2mM

BSA，終濃度0.008-0.012g/ml。

10.權利要求9的方法，其中所述復蘇液為DMEM或DMEM/F?12培養液中包含：

1×B27添加劑，

1×N2添加劑，

L-谷氨酰胺，終濃度為2.0mM

丙酮酸鈉，終濃度為1.0mM

NAC，終濃度1.0mM

BSA，終濃度0.01g/ml

11.權利要求1-10任一項的方法，其中復蘇的過程包括：

將液氮中的凍存細胞取出，在35℃至45℃，優選在38℃至42℃，最優選在40℃水浴中溫育1.5-2.5分鐘，然后加入復蘇液重懸。