[發明專利]伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒及制備方法

無效

• 申請號: 201110093874.2
• 申請日: 2011-04-14
• 公開（公告）號: CN102191324A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 張西臣;蘇利波;王景林;李建華;宮鵬濤;王明山;楊舉;張國才;李赫;任文陟;張楠;李淑紅
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開一種伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒，用于伊氏錐蟲與路氏錐蟲快速PCR檢測，本發明還提供了該試劑盒的制備方法，屬于寄生蟲檢測技術領域。

背景技術

錐蟲（Trypanosoma）是哺乳動物血液中的一種常見鞭毛蟲，是一類具有廣泛宿主的人畜共患寄生原蟲，流行于亞非拉美各大洲。在不同洲流行種類也有所不同，在亞洲及我國主要流行伊氏錐蟲(Trypanosoma?evansi)和路氏錐蟲(Trypanosoma?lewisi)。伊氏錐蟲傳播途徑主要經吸血昆蟲機械性傳播和胎盤感染。在畜牧養殖業中可引起家畜的伊氏錐蟲病，造成家畜日漸消瘦，甚至死亡。Joshi等報道印度有感染人的病例。此外，路氏錐蟲在世界各地嚙齒動物的感染也較為普遍，主要寄生在褐鼠體內，自然條件下通過媒介蚤傳播，國外已有人體感染病例報道，2007年有報道泰國確診病例為路氏錐蟲感染；印度也有類似報道。有調查報道我國東北部地區人群中路氏錐蟲抗體陽性，人群中可能存在亞臨床或誤診病例，目前給我國畜牧業和公共衛生也帶來了新的威脅。

發明內容

本發明提供一種伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒，可用于伊氏錐蟲與路氏錐蟲的同時快速鑒別和檢測。

本發明進一步提供了上述試劑盒的制備方法。

本發明的多種重要水源性人獸共患原蟲同時檢測試劑盒，包括以下部分：

（1）樣本裂解液與DNA提取試劑

樣本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，濃度配比為：NaCl?100mM、Tris-HCl(pH?7.5)20Mm、EDTA?25?Mm、SDS?2%（w/v）和蛋白酶K?0.1μg/μl；

DNA提取試劑為酚:氯仿:異戊醇（24:25:1）。

（2）PCR反應液：含反應終濃度各100-300μM的4種dNTPs，反應終濃度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌蒸餾水。

（3）二重PCR引物：

伊氏錐蟲引物TE-a與TE-s，路氏錐蟲引物TL-a與TL-s；

（4）陽性對照：陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA。

（5）陰性對照：取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本。

本發明的試劑盒可以含有瓊脂糖Agarose（99.0%）、溴酚藍點樣緩沖液（5U/μL）和Taq酶（5U/μL），溴化乙錠（10μg/μL）；還可以含有PCR反應管。

本發明所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

（1）樣本裂解液與DNA提取試劑

樣本裂解液：將NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，濃度配比為：NaCl?100mM、Tris-HCl(pH?7.5)20Mm、EDTA?25?Mm、SDS?2%（w/v）和蛋白酶K?0.1μg/μl；

DNA提取試劑為酚:氯仿:異戊醇（25:24:?1）。

（2）二重PCR引物：

在GeneBank上比對選取伊氏錐蟲和路氏錐蟲特異診斷基因，分別RoTat?1.2?VSG基因和18S?rRNA基因。

伊氏錐蟲（擴增片段大小為482bp）：

TE-a：5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3'

TE-s：5'GCCCGCAGTTGCCTAT3'

路氏錐蟲（擴增片段大小為261bp）：

TL-a：5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3'

TL-s：5'?TGCGCGAGAAGAGAGGACT?3'

（3）PCR反應液，含反應終濃度各100-300μM的4種dNTPs，反應終濃度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌雙蒸水；

（4）陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA，比較PCR產物以及監測PCR操作過程是否正確；

（5）陰性對照：取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本，目的在排除反應液中的核酸污染和操作過程中的假陽性問題。

本發明的積極效果在于：利用二重PCR特異性檢測方法，根據伊氏錐蟲和路氏錐蟲種特異基因序列設計引物，通過優化PCR反應體系和條件來提高其敏感性，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。本發明可同時對伊氏錐蟲和路氏錐蟲進行快速準確的檢測與鑒別，具有簡單方便、靈敏度高、特異性強等特點。

附圖說明

圖1為本發明二重PCR特異性驗證圖；