[發明專利]伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒及制備方法

無效

• 申請號: 201110093874.2
• 申請日: 2011-04-14
• 公開（公告）號: CN102191324A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 張西臣;蘇利波;王景林;李建華;宮鵬濤;王明山;楊舉;張國才;李赫;任文陟;張楠;李淑紅
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.?一種伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒，包括以下部分：

（1）樣本裂解液與DNA提取試劑

樣本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，濃度配比為：NaCl?100mM、Tris-HCl(pH?7.5)20Mm、EDTA?25?Mm、SDS?2%（w/v）和蛋白酶K?0.1μg/μl；

DNA提取試劑為酚:氯仿:異戊醇（24:25:1）；

（2）PCR反應液：含反應終濃度各100-300μM的4種dNTPs，反應終濃度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌蒸餾水；

（3）二重PCR引物：

伊氏錐蟲引物TE-a與TE-s，

路氏錐蟲引物TL-a與TL-s；

（4）陽性對照：陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA；

（5）陰性對照：取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本。

2.?根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：

還可以含有瓊脂糖（99.0%）、溴酚藍點樣緩沖液（5U/μL）和Taq酶（5U/μL），溴化乙錠（10μg/μL）；還可以含有PCR反應管。

3.?權利要求1所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

（1）樣本裂解液與DNA提取試劑

樣本裂解液：將NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，濃度配比為：NaCl?100mM、Tris-HCl(pH?7.5)20Mm、EDTA?25?Mm、SDS?2%（w/v）和蛋白酶K?0.1μg/μl；

DNA提取試劑為酚:氯仿:異戊醇（25:24:?1）

（2）二重PCR引物：

在GeneBank上比對選取伊氏錐蟲和路氏錐蟲特異診斷基因，分別RoTat?1.2?VSG基因和18S?rRNA基因；

伊氏錐蟲（擴增片段大小為482bp）：

TE-a：5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3'

TE-s：5'GCCCGCAGTTGCCTAT3'

路氏錐蟲（擴增片段大小為261bp）：

TL-a：5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3'

TL-s：5'?TGCGCGAGAAGAGAGGACT?3'

（3）PCR反應液，含反應終濃度各100-300μM的4種dNTPs，反應終濃度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌雙蒸水；

（4）陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA，比較PCR產物以及監測PCR操作過程是否正確；

（5）陰性對照：取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本；

（6）組裝試劑盒。