[發明專利]沙冬青抗旱基因的篩選方法

無效

• 申請號: 201110093513.8
• 申請日: 2011-04-14
• 公開（公告）號: CN102732527A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 夏新莉;尹偉倫;郭麗麗;龐濤
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及基因的篩選方法，尤其涉及一種沙冬青抗旱基因的篩選方法。

背景技術

非生物脅迫是現代農業的嚴重危害，特別是干旱，成為影響農業的最重要的因素之一。近年來，由于我國工業發展迅速，環境遭到污染，溫室效應日趨嚴重。隨著溫度的不斷升高及沙漠化擴大的影響，我國農業受到了干旱的嚴重的影響。目前我國有超過50％的可耕種農地受到干旱影響，有20％的可耕種農地的旱情嚴重。即使是在降水量較多的華中及其華南地區，由于降水量分布不均勻，這些地區的農作物比如水稻幾乎每年都在揚花的關鍵時期受到干旱影響，從而直接影響產量，旱情嚴重的甚至顆粒無收；而我國北方大部分地區，本來降水量就偏低，再加上日趨嚴重的旱情，農業的發展狀況更是不容樂觀。我國作為農業大國，供養著接近世界人口的四分之一的人口，因此農業對于我國乃至全世界都是重中之重。

對于抗旱，世界各種的植物學研究工作者們一直將其作為重點研究課題，為此做了大量的工作，也取得了長足的進步。目前，對于植物抗旱，一般傾向于篩選抗旱基因，然后采用抗旱基因進行抗旱植株育種的方式得到抗旱性好的植株，因而通過篩選，獲得良好的抗旱基因就成為抗旱育種的關鍵。

發明內容

本發明的目的在于克服上述不足，提供一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，它能夠迅速有效地篩選出沙冬青的抗旱基因。

為了達到上述技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，包括以下步驟

1)取干旱處理的沙冬青

2)采用2×CTAB的方法提取RNA

3)RNA純化

4)反轉錄合成cDNA

5)高通量測序

6)獲取差異表達序列

7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因。

沙冬青具有很低的水勢和蒸騰強度，而束縛水含量很高，沙冬青不但水勢低，吸水能力很強，而且從葉到莖都具有抑制蒸騰失水的旱生結構。可見沙冬青抗旱性優秀，選用沙冬青來篩選抗旱基因，能夠獲得優良的抗旱基因。

上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述沙冬青的種子使用70％體積比的乙醇浸泡，然后用10％質量比的次氯酸鈣消毒后，使用無菌水沖洗。

上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，步驟2)提取RNA經過以下流程

(1)將沙冬青真葉或莖段于-20℃研磨成粉，加入預熱65℃的緩沖液，震蕩，于65℃水浴

(2)加入苯酚/氯仿/異戊醇，于4℃離心，取上清

(3)加入LiCl，-20℃放置

(4)棄上清，70％體積比乙醇漂洗沉淀

(5)除去乙醇，加入無水乙醇-20℃放置

(6)于4℃離心，采用DEPC處理的水溶解沉淀

(7)瓊脂糖凝膠電泳，電壓檢測，-70℃貯藏。

上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟(2)、(3)重復兩次。

上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟5)測序后進行污染分析，隨機選取若干條讀長組裝后，于NCBI?NR數據庫進行比對。

上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟5)測序后使用DNASTARNGEN軟件將測序結果和野生型測序結果進行組合組裝。

上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟6)中將獲得差異表達基因進行初步篩選，選取差異表達4倍以上的基因。

上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟6)、7)中應用DNASTAR：ArrayStar軟件對轉錄組進行了差異表達分析。

本發明相比現有技術具有以下優點：

(1)本發明沙冬青抗旱基因的篩選方法，選用沙冬青來篩選抗旱基因，能夠獲得優良的抗旱基因。

(2)本發明沙冬青抗旱基因的篩選方法，對沙冬青的轉錄組進行分析以篩選抗旱基因，能夠全面、準確地篩選出優良的抗旱基因。

附圖說明

圖1為野生型沙冬青測序結果污染鑒定圖

圖2為本發明干旱處理沙冬青測序結果污染鑒定圖。

具體實施方式

下面結合附圖及實施例對本發明進行進一步的說明：

本發明沙冬青抗旱基因的篩選方法較佳依次含有以下步驟：

1、實驗材料處理