[發明專利]沙冬青抗旱基因的篩選方法

無效

• 申請號: 201110093513.8
• 申請日: 2011-04-14
• 公開（公告）號: CN102732527A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 夏新莉;尹偉倫;郭麗麗;龐濤
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

1.一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：包括以下步驟

1)取干旱處理的沙冬青

2)采用2×CTAB的方法提取RNA

3)RNA純化

4)反轉錄合成cDNA

5)高通量測序

6)獲取差異表達序列

7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因。

2.根據權利要求1所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：所述沙冬青的種子使用70％體積比的乙醇浸泡，然后用10％質量比的次氯酸鈣消毒后，使用無菌水沖洗。

3.根據權利要求1所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟2)提取RNA經過以下流程

(1)將沙冬青真葉或莖段于-20℃研磨成粉，加入預熱65℃的緩沖液，震蕩，于65℃水浴

(2)加入苯酚/氯仿/異戊醇，于4℃離心，取上清

(3)加入LiCl，-20℃放置

(4)棄上清，70％體積比乙醇漂洗沉淀

(5)除去乙醇，加入無水乙醇-20℃放置

(6)于4℃離心，采用DEPC處理的水溶解沉淀

(7)瓊脂糖凝膠電泳，電壓檢測，-70℃貯藏。

4.根據權利要求3所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟(2)、(3)重復兩次。

5.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟5)測序后進行污染分析，隨機選取若干條讀長組裝后，于NCBI?NR數據庫進行比對。

6.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟5)測序后使用DNASTAR?NGEN軟件將測序結果和野生型測序結果進行組合組裝。

7.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟6)中將獲得差異表達基因進行初步篩選，選取差異表達4倍以上的基因。

8.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于：所述步驟6)、7)中應用DNASTAR：ArrayStar軟件對轉錄組進行了差異表達分析。