[發明專利]小麥TaTOC1基因及其克隆方法和應用

無效

• 申請號: 201110093145.7
• 申請日: 2011-04-14
• 公開（公告）號: CN102220347A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 張憲省;趙翔宇;陳祥彬;葉興國;潘衍有
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/84;A01H5/00
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技術領域

本發明涉及小麥TaTOC1基因及其克隆方法與應用，屬于農作物轉基因技術領域。

背景技術

植物由營養生長階段向生殖生長階段的轉變，即成花轉變，是植物完成整個生活周期的關鍵步驟。植物開花時間受內在發育信號和外部的環境信號共同控制。近些年來的研究表明，主要有四條途徑控制開花，分別為光周期促進途徑、自主促進途徑、春化促進途徑和GA促進途徑。光周期現象是生物鐘調控的諸多過程的一個特例，它是由生物鐘和光信號共同作用的結果。光周期的感應器可以使植物準確地感知日照長度的變化，從而選擇性地在合適的季節開花。過量表達LHY/CCA1和TOC1三個基因中的任一個都會導致轉基因植株的晝夜節律性的破壞(Schaffer?et?al.，1998；Wang?and?Tobin，1998)，這說明它們是植物中心振蕩器的核心元件。TOC1基因屬于擬南芥PRR基因家族，它編碼的蛋白含有非典型的接收域(pseudo-receiver?domain)和CCT(CO，COL，and?TOC1)結構域(Makino?et?al.，2000)，采用模式化和聚類分析的方法證明了這兩個結構域可能分別發揮響應信號和轉錄調控的功能(Kolmos?et?al.，2008)。TOC1基因的mRNA和蛋白水平呈現晝夜節律性的積累，這種情況即使是在持續光照或持續黑暗的條件下依然表現的很明顯(Strayer?et?al.，2000；Más?et?al.，2003b)。但最近的研究發現，TOC1在持續光照條件下的晝夜節律性表達的現象在擬南芥的根里并沒有被檢測到，而在莖中卻有很明顯的節律性的TOC1mRNA量的積累，這說明TOC1在不同器官中的作用模式很可能不同，這也用分子的證據說明植物不同器官的生物鐘是具有特異性的，但并不排除不同器官的生物鐘之間的相互聯系與調控(James?et?al.，2008)。

擬南芥TOC1的第562位丙氨酸突變成纈氨酸后產生了toc1-1，它是一種弱的功能缺失型突變體，toc1-1的生物鐘的晝夜節律周期相對于野生型擬南芥變短(Somers?et?al.，1998；Strayer?et?al.，2000)。而擬南芥中增加TOC1的表達時，植株的生物鐘周期變長；當TOC1被過量表達時，轉基因擬南芥的生物鐘則完全變得紊亂(Makino?et?al.，2002；Más?et?al.，2003a)。這些都說明TOC1在維持生物鐘正常節律方面的重要功能。因此，可以利用植物轉基因技術來調節植物的生長發育周期。

長日照植物小麥是世界上重要的糧食作物之一。人們試圖通過對育種和栽培方式的探索來改善其產量和品質。傳統的主要育種手段之一是引種，即把外地或外國優良的作物品種引入當地，作為推廣品種或是育種材料應用。但是小麥要完成從種子到種子的一個生長發育周期，必須通過春化階段和光照階段，否則就不能正常結實獲取產量。但是由于全球各地的光照、溫度等氣候條件差異很大，所以引種工作受到很大的限制。如果能夠利用生物技術手段調節小麥的生長發育周期，那么引種的范圍就能夠極大的擴大。

小麥是最重要的糧食作物之一，是人類食物和營養的基本來源。依賴于基因工程的進展可以解決目前我國小麥生產面臨的干旱、病蟲害以及遺傳育種中優良品種引種范圍窄等問題。由于小麥的遺傳背景較其它作物復雜，遺傳轉化困難，因此是三個重要的禾本科作物中最后一個獲得轉基因成功的。盡管從1992年以來利用基因槍法、花粉管通道法、農桿菌介導法、PEG法、電擊法和激光微束法分別獲得了轉基因小麥，但其轉化率未超過6％。由基因槍法等物理轉化方法獲得的轉基因小麥存在外緣基因的拷貝數多、再生困難和不育等缺陷。小麥轉化技術已成為限制小麥基因工程研究發展的重要因素。由于這種限制，至今已獲得的有經濟應用價值的轉基因小麥極其有限。

在現有的小麥轉化技術中，農桿菌介導的小麥遺傳轉化一直是國內外相關領域的熱點和難點。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次報道了以小麥幼胚和胚性愈傷組織為外植體獲得了農桿菌介導的轉基因(npt?II)再生植株，并提出了一套較為成熟的轉化系統。1999年我國的夏光敏也報道了用農桿菌介導法將npt?II基因導入小麥幼胚和胚性愈傷組織，得到轉基因植株，轉基因頻率達到3.7-5.9％，明顯高于其它小麥轉化研究。但這些轉化方法均需經過組織培養再生植株。已有的研究表明小麥不同基因型的受體材料對植株再生有顯著影響。目前已知小麥幼胚和胚性愈傷組織的再生能力較高，但受基因型的限制很大，而我國多數生產用小麥當家品種，由愈傷組織分化再生非常困難，這限制了需經組織培養途徑進行遺傳轉化技術的應用。