[發(fā)明專利]檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110090869.6
• 申請日: 2011-04-12
• 公開（公告）號: CN102199211A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王保民;譚桂玉;南鐵貴;趙洪偉;高巍;王敏;孫碩;曹振;李召虎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/38
• 分類號: C07K16/38;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/543;G01N21/31;C12R1/91
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。

背景技術(shù)

豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的Bowman-Birk類型的雙頭蛋白酶抑制劑，即一個抑制劑分子可以抑劑兩個胰蛋白酶分子的催化活性。自上世紀80年代，CpTI基因作為一種抗蟲基因成為轉(zhuǎn)基因植物的備選基因，并在表達后與非轉(zhuǎn)基因植物相比表現(xiàn)出優(yōu)良的抗蟲特性，目前已成為我國眾多轉(zhuǎn)基因棉花品種中所攜帶的基因。準確評價CpTI轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)和食品安全性、進行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的強制標識，檢驗和監(jiān)測轉(zhuǎn)基因作物種子的純度等，必須建立起一套具有自主知識產(chǎn)權(quán)的快速、準確的外源基因表達蛋白的檢測方法。目前檢驗CpTI轉(zhuǎn)基因植物常用的方法是基因?qū)用娴姆肿訖z測方法。由于酶聯(lián)免疫測定技術(shù)具有高通量、快速及靈敏度高等特點，在轉(zhuǎn)基因植物鑒定等方面已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng)用，但CpTI的雙抗夾心酶免疫檢測方法還未見報道，所以建立一種精確的CpTI免疫檢測方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體。

本發(fā)明所提供的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC?No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細胞株CpTI?3D6分泌產(chǎn)生的。

本發(fā)明的另一個目的是提供保藏編號為CGMCC?No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體雜交瘤細胞株CpTI?3D6。

所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體在制備檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的又一個目的是提供一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明所提供的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的酶聯(lián)免疫試劑盒，含有所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑的多克隆抗體、豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品；所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品為豇豆胰蛋白酶抑制劑。

所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品的濃度為100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL和0.39ng/mL。

所述豇豆胰蛋白酶抑制劑標準品按照包括如下步驟的方法制備得到的：

(1)將豇豆種子粉浸泡于質(zhì)量百分比為0.3％的氯化鈉水溶液中，得到浸泡后的混合物；將所述浸泡后的混合物離心，取上清液，即得到提取液；將所述提取液用飽和硫酸銨溶液進行鹽析粗純化，取30％-60％鹽溶度間的蛋白溶液，即得到粗純化的豇豆胰蛋白酶抑制劑溶液；所述浸泡的溫度為4℃和浸泡時間為16h；所述粗純化的溫度為4℃和粗純化時間為4h；

(2)將步驟(1)得到的粗純化的豇豆胰蛋白酶抑制劑溶液在以下條件下進行凝膠過濾：葡聚糖G-50填料，16mmx100cm層析柱，0.1M?pH7.0PBS緩沖液洗脫，流速0.3ml/h，1.5mL/管進行分步收集，取活性高部分濃縮，得到濃縮液；

(3)將步驟(2)得到的濃縮液在以下條件下進行親和層析：CNBr-Sepherose4B填料，以豬胰蛋白酶作為配基，上樣緩沖液為0.1M?pH7.0PBS緩沖液，洗脫液為0.1MpH3.0甘氨酸-HCL緩沖液，流速1mL/min，每1mL進行分步收集，取濃度高收集液合并，0.1M?PH7.0PBS緩沖液透析凍干，用體積比為1∶1的水∶甘油混合液進行溶解，即豇豆胰蛋白酶抑制劑。

所述試劑盒中含有用于標記所述豇豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的標記酶。

所述試劑盒中包括包被緩沖液、洗滌液、底物緩沖液、終止緩沖液和封閉液；

所述包被緩沖液由Na₂CO₃、NaHCO₃和水組成；

以上各成分在包被緩沖液中的濃度分別為：Na₂CO₃0.01M和NaHCO₃0.04M；

所述洗滌液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、吐溫-20和水組成；

以上各成分在洗滌液中的濃度分別為：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和吐溫-20的體積百分比濃度為0.1％；