[發明專利]雙重聚合酶鏈反應方法檢測海水樣品中的創傷弧菌和副溶血弧菌

無效

• 申請號: 201110090819.8
• 申請日: 2011-04-12
• 公開（公告）號: CN102732599A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 王林同;朱琳;王軻;明紅霞
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于環境科學水體病原微生物檢測領域，是應用聚合酶鏈式反應(全稱Polymerase?Chain?Reaction，簡稱PCR)技術，將微量目的DNA片段擴增，快速檢測水樣中的創傷弧菌和副溶血弧菌，評價并預警海洋環境這兩種致病菌的污染情況。

背景技術：

創傷弧菌(Vibrio?vulnificus)是一種革蘭氏陰性弧菌，能通過傷口、飲食不衛生的海產品而感染人體，導致腹瀉嘔吐、心動過速、肌炎、肌肉壞死，引發敗血癥，甚至危及生命。副溶血性弧菌(Vibrio?parahaemolyticus)，又稱嗜鹽菌，也是革蘭氏陰性菌，能分泌制熱性溶血素以及類似溶血毒，具有溶血活性、腸毒素和致死作用，能引起人類腹痛腹瀉、嘔吐、胃黏膜炎，甚至內臟淤血。2003年和2005年，據我國食源性疾病爆發的監測資料分析，微生物性食源疾病爆發中，均以副溶血弧菌引起的疾病暴發為首，分別為21.0％和40.1％。這兩種致病菌在海洋中均廣泛分布，許多海產品中也含有這兩種病原微生物，威脅人類的生命健康安全。

用常規的生物學方法對樣品進行檢測，比較費時費力，一般需要5-7天。隨著PCR(聚合酶鏈反應)技術的發展，因其操作簡便、特異性強、靈敏度高的特性，已有學者進行了將PCR技術應用于樣品檢測方面的研究，以期達到快速、準確地檢測病原微生物。雙重PCR在常規PCR基礎上，向同一反應體系中加入兩對引物，同時擴增出兩段DNA片段，這樣更加節省了時間和成本。因此建立雙重PCR方法快速檢測海水樣品中的創傷弧菌和副溶血弧菌具有重要的實際意義和應用價值，適于推廣。

發明內容：

本發明的目的是提供一種能夠準確快速地檢測海水樣品中創傷弧菌和副溶血弧菌的檢測方法。雙重PCR的關鍵是針對兩種細菌的保守序列設計兩對退火溫度相同的引物，檢測時間只需6-8個小時。

本發明是通過以下技術方案實現的：

1、用于雙重PCR的兩對引物核苷酸序列如下：

Vv-F：ATGTTTATGGTGAGAACGGT

Vv-R：GGGGTTACTTGAACATTACG

Vp-F：AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG

Vp-R：GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC

2、DNA模板的準備

將創傷弧菌和副溶血弧菌分別接種到已滅菌的LB液體培養基中，振蕩18小時(創傷弧菌于28℃，副溶血弧菌于37℃)，所得的菌液用已過濾的無菌海水稀釋一定的倍數，用試劑盒提取兩種細菌的基因組DNA。

3、雙重PCR反應

(1)反應的液體總體積為25μl，體系組成如下：