[發(fā)明專利]雙重聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110090819.8
• 申請(qǐng)日: 2011-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN102732599A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王林同;朱琳;王軻;明紅霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.雙重聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，其特征在于將這兩種致病菌的引物加入到同一體系中，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

1)、用于雙重PCR的兩對(duì)引物核苷酸序列如下：

Vv-F：ATGTTTATGGTGAGAACGGT

Vv-R：GGGGTTACTTGAACATTACG

Vp-F：AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG

Vp-R：GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC

2)、DNA模板的準(zhǔn)備

將創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌分別接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩18小時(shí)(創(chuàng)傷弧菌于28℃，副溶血弧菌于37℃)，所得的菌液用已過濾的無菌海水稀釋一定的倍數(shù)，用試劑盒提取兩種細(xì)菌的基因組DNA。

3)、雙重PCR反應(yīng)

(1)反應(yīng)的液體總體積為25μl，體系組成如下：

??成分??體積(μl)??終濃度??10×Buffer??2.5??1×Buffer??MgCl₂(25mM)??2.5??2.5mM??4×dNTPs(10mM)??2??0.8mM??Tap酶(5U/μl)??0.25??0.05U??Vv-F(10mM)??1??0.4mM??Vv-R(10mM)??1??0.4mM??Vp-F(10mM)??1??0.4mM??Vp-R(10mM)??1??0.4mM??創(chuàng)傷弧菌DNA模板??2??副溶血弧菌DNA模板??2??雙蒸水??9.75

(2)雙重PCR擴(kuò)增程序如下：

①94℃預(yù)變性5分鐘；

②三溫循環(huán)35次：

94℃變性40秒；

58℃退火1分鐘；

74℃延伸1分鐘；

③74℃終延伸10分鐘

(3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

雙重PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，2％的膠中含0.5mg/ml的EB(用于將DNA片段染色)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為300bp和450bp。

2.權(quán)利要求1所述的雙重聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，可用于檢測(cè)海水樣品以及其他水樣中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌。