[發(fā)明專利]一種利用甘藍(lán)游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110089092.1
• 申請日: 2011-04-11
• 公開（公告）號: CN102204513A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張恩慧;馬勇斌;程永安;楊安平;許忠民;朱守亮;高海娜;馬英夏;李偉;王朝陽
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G9/10
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)和植物育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用一種植物單倍體育種方法創(chuàng)制足夠數(shù)量純合育種自交系資源，尤其是一種利用甘藍(lán)游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法。

背景技術(shù)

甘藍(lán)(Brassica?oleracea?L.)原產(chǎn)于地中海沿岸，為十字花科蕓薹屬二年生異花授粉作物，春化需要植株生長到一定體積大小，才能感應(yīng)低溫，通過春化，屬綠體春化型，其具有十分明顯的雜種優(yōu)勢。甘藍(lán)一代雜種在國內(nèi)外已被普遍應(yīng)用，其優(yōu)良一代雜交種的育種研究是以豐富優(yōu)良、遺傳性穩(wěn)定的純合自交系為基礎(chǔ)的。目前，國內(nèi)外甘藍(lán)優(yōu)良自交系選育主要采用兩條途徑，一條是通過常規(guī)育種靠多代連續(xù)自交定向選擇獲得，一條是通過單倍體育種采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得穩(wěn)定雙單倍體純合系(DoubleHaploid簡稱DH株系)；前者常規(guī)育種方法，自交系純合選育周期較長，一般需要6～8年，后者單倍體生物技術(shù)育種，它是一種快速純合自交系和創(chuàng)制新育種資源的有效育種途徑，創(chuàng)制自交系周期較短，僅需2～3年，育種效率顯著，但技術(shù)難度較大。甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中除普遍存在小孢子發(fā)育的同步性較差，成胚率遠(yuǎn)低于其他蕓薹屬作物，即使誘導(dǎo)成胚，一個(gè)小孢子胚狀體僅能再生同一基因型1～2個(gè)DH植株，即使胚狀體不定芽再經(jīng)2～3次繼代后也只能得到同一來源小孢子胚狀體4～6個(gè)DH株，不利DH植株群體農(nóng)藝性狀提早鑒定、也延遲了育種年限，這些問題不僅影響著甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)有效應(yīng)用，而且也阻礙著甘藍(lán)雜種一代新品種的快速選育。因此，我們針對甘藍(lán)植物學(xué)特性，為了提高甘藍(lán)單倍體育種中游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用效率，研究發(fā)明出一種利用甘藍(lán)游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法成為該領(lǐng)域的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用甘藍(lán)游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法。采用如下技術(shù)方案：

一種利用甘藍(lán)游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法，包括以下步驟：

A1，胚狀體不定芽誘導(dǎo)；A2，外植體獲得：以小孢子胚狀體誘導(dǎo)出不定芽葉片達(dá)1cm時(shí)起計(jì)算葉片生長日齡，選用一定生長日齡的葉片作為離體培養(yǎng)的外植體。在超凈工作臺上將培養(yǎng)有胚狀體不定芽的試管外部消毒后，隨后打開試管口從葉柄處剪下葉片，然后將葉片切成1.0cm見方的小方塊；A3，外植體再生芽的分化誘導(dǎo)，將步驟A2獲得的外植體接種于外植體再生芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度(25±1)℃，光照16h·d^-1，光強(qiáng)為2000lx的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)；A4，再生芽的生根誘導(dǎo)與移栽，剪下長有3～4片葉的再生芽插入MS+NAA?0.3mg·L^-1生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根；當(dāng)DH株根系長至4～5cm左右時(shí)開始煉苗，三角瓶封口膜先半開半閉，2天后完全打開，7天后取出DH株小苗將根部殘留培養(yǎng)基用流水洗凈，移栽到裝有專用培養(yǎng)土，即體積比為培養(yǎng)土∶珍珠巖∶蛭石＝2∶1∶1的培養(yǎng)缽中，同時(shí)將培養(yǎng)缽放至有少量水的穴盤之中并置于半陰處，加強(qiáng)澆水管理，1周后帶基質(zhì)移栽到大田中。

所述的方法，優(yōu)選的，步驟A2中，所述的外植體葉片生長日齡為25天。

所述的方法，優(yōu)選的，所述外植體再生芽分化培養(yǎng)基為：MS+6-BA?2.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+GA₃1.5mg·L^-1；蔗糖、瓊脂濃度和pH值分別為30g·L^-1、8g·L^-1和5.8。

本發(fā)明選擇合適生長日齡的甘藍(lán)小孢子胚狀體不定芽葉片為外植體來源，在所述分化培養(yǎng)基上快速誘導(dǎo)分化成再生芽，再經(jīng)生根移栽，獲得大量健壯的甘藍(lán)DH植株。該方法具有彌補(bǔ)甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中1個(gè)小孢子胚狀體誘導(dǎo)出不定芽僅能再生出少量DH株的數(shù)量不足，在短時(shí)間內(nèi)將有限的同一基因型的小孢子DH植株數(shù)量擴(kuò)大32倍以上，從而在當(dāng)年獲得足夠數(shù)量能夠達(dá)到農(nóng)藝性狀鑒定標(biāo)準(zhǔn)的、確保通過綠體春化體積大小的同一基因型的小孢子DH群體，克服了甘藍(lán)游離小孢子常規(guī)多次繼代培養(yǎng)存在小孢子不定芽生長勢減弱、繼代成活率低、生長周期長、DH植株群體和體積均過小，不利性狀選擇和難以春化等諸多缺陷，實(shí)現(xiàn)了當(dāng)年經(jīng)濟(jì)性狀田間鑒定和次年花期配合力測定，達(dá)到比普通小孢子培養(yǎng)育種縮短1年時(shí)限，從而提高甘藍(lán)育種效率。

附圖說明

圖1中A為小孢子子葉型胚狀體；B為子葉型胚狀體在分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的不定芽

圖2中A為外植體培養(yǎng)3天時(shí)的生長表現(xiàn)；B為外植體在所述培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的再生芽；