[發(fā)明專利]丹參內(nèi)生真菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110087974.4
• 申請日: 2011-04-08
• 公開（公告）號: CN102676392A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓婷;明乾良;秦路平;張巧艷;黃寶康;張宏;鄭承劍;黃芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P33/20;C12R1/885
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 潘詩孟

1.一種丹參內(nèi)生真菌，其特征在于，它的命名為深綠木霉Trichoderma?atroviride，其保藏登記號為CGMCC?No.4712。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參內(nèi)生真菌，其特征在于，它的顯微形態(tài)為：培養(yǎng)的菌絲體無色、分枝繁復(fù)，由具有橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，分枝角度為近似90°；分生孢子梗的可育延伸物沒有或者很少產(chǎn)生，沒有不育的菌毛；雖然成對著生的分枝比較常見，但是分生孢子梗的典型分枝方式為單側(cè)分枝；分生孢子綠色，亞球形至卵圓形，沒有明顯的脫落痕跡，光滑，成簇著生于分生孢子梗的頂端。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參內(nèi)生真菌，其特征在于，它的固體培養(yǎng)為PDA培養(yǎng)基上26℃培養(yǎng)，生長迅速，菌落在3天內(nèi)覆蓋直徑80mm的平板，呈輻射狀，表面疏松、平坦，菌絲無色；在培養(yǎng)的第5天明顯可見有孢子產(chǎn)生，最初為淡綠色，以后逐漸增多，呈現(xiàn)深綠色，產(chǎn)孢叢束排列成同心的輪紋；有椰子氣味。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參內(nèi)生真菌，其特征在于，它的液體培養(yǎng)為

(1)培養(yǎng)基PDA，搖瓶培養(yǎng)10天，培養(yǎng)溫度26±1℃；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)特征：

培養(yǎng)第1-2天有少許1-2mm白色菌絲球出現(xiàn)，培養(yǎng)液澄清；培養(yǎng)第3-4天，菌絲球直徑增大至3-4mm，培養(yǎng)液開始變渾濁；培養(yǎng)第5-8天，菌球數(shù)量增多，培養(yǎng)液渾濁；培養(yǎng)第9-10天，白色菌球體直徑為4-5mm，培養(yǎng)液又變澄清。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參內(nèi)生真菌，其特征在于，它的ITS和5.8S?rDNA堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示為：

CCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCG

GGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCA

ACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAA

ATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGA

ACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT

TGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTC

AACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACG

GGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT

TTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCT

GAAATG。

6.如權(quán)利要求1-5中任何一項所述的丹參內(nèi)生真菌在制備丹參酮類化合物丹參酮I和丹參酮II?A中的應(yīng)用。

7.根據(jù)根據(jù)要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，丹參內(nèi)生真菌制備丹參酮類化合物丹參酮I和丹參酮II?A包括下列步驟：

(1)取丹參內(nèi)生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管，于26±1℃活化培養(yǎng)72小時；

(2)取活化培養(yǎng)后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體培PDA種子培養(yǎng)基中，26±1℃下180rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子；

(3)配制好的PDA液體培養(yǎng)基，分裝入250ml的三角瓶中，每瓶約100ml，滅菌處理，冷卻備用；無菌條件下，按照10％的接種量接種入種子，26±1℃下180rpm搖床培養(yǎng)10天；

(4)發(fā)酵完畢，收集培養(yǎng)物過濾后，將菌絲體懸于5倍體積的甲醇中勻漿5min，超聲處理45min；而后過濾減壓蒸干，甲醇復(fù)溶殘留物既得丹參酮類化合物丹參酮I和丹參酮II?A。