[發明專利]高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因及其表達蛋白的用途

有效

• 申請號: 201110087515.6
• 申請日: 2011-04-08
• 公開（公告）號: CN102212527A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 杜以軍;齊靜;王金寶;吳家強;張秀美
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/21
• 分類號: C12N15/21;C12N15/79;C12N15/10;A61K38/21;A61P31/14
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.一種權利要求1所述序列2的基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。

3.一種權利要求1所述的豬α干擾素基因的合成方法，其特征是包括以下步驟

3.1將真核質粒pVAX1^?改造為pMVAX1^?：

由GenBank公布的Rabbit?β-Globin?Intron?II基因序列GenBank?No:?V00882，在上游引入SstI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和EcoRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將此段基因序列通過SstI/EcoRI酶切位點插入pVAX1^?載體中，轉化感受態細菌，提取質粒經篩選得到SstI/EcoRI雙酶切陽性克隆，命名為pMVAX1^?；

所述pCMV即刻早期啟動子的一段序列為：5’-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’，

所述T7啟動子序列為：5’-AATACGACTCACTATAGGG-3’；

3.2構建表達pIFN-α的重組真核質粒pMVAX1^?-pIFN-α：

3.2.1設計一對擴增pIFN-α成熟蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下：

pIFN-α-Fwd：5’-TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3’，

pIFN-α-Rev：5’-GAGCTCGAGAAGCTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’，

在上游引物pIFN-α-Fwd的5’端引入EcoRI限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pIFN-α-Rev的5’端引入XhoI限制性內切酶位點；

3.2.2從豬的脾或血淋巴細胞提取RNA，經反轉錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術擴增出pIFN-α的成熟蛋白基因的PCR產物；

3.2.3用EcoRI/XhoI雙酶切pMVAX1^?，膠回收得包含序列1的載體基因片段1，?pIFN-α的成熟蛋白基因的PCR產物經EcoRI/XhoI雙酶切并膠回收得到編碼pIFN-α成熟蛋白的基因片段2，將載體基因片段1和基因片段2連接，轉化感受態細菌，培養，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養基中培養，提取質粒，進行EcoRI/XhoI雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得pMVAX1^?-pIFN-α，真核質粒pVAX1^?中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。

4.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟3.2.2中PCR反應體系為25μL中，含cDNA?1μL，Mg²⁺?1.5mmol/L，dNTP?200μmol/L，10×LA?PCR?Buffer?2.5μL，pIFNα-Fwd和pIFNα-Rev濃度均為400nmol/L，TaKaRa?LA?Taq?2U；反應條件為：預變性95℃?5min，然后進行35個循環，循環條件為95℃?45s，62℃?45s，72℃?1min；然后72℃延伸10min，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

5.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟3.2.2中RNA的提取步驟如下：無菌采集豬的脾臟或外周血，用淋巴細胞分離液分離脾或者血液淋巴細胞，用10%胎牛血清的1640液在37℃含CO_2??5v%的環境中培養1h，然后加入500μg/mL的植物血凝素PHA刺激12h，用TRIzol試劑提取總RNA。

6.一種權利要求1所述的豬α干擾素基因的表達蛋白在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。