[發(fā)明專利]高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因及其表達蛋白的用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110087515.6
• 申請日: 2011-04-08
• 公開（公告）號: CN102212527A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發(fā)明（設計）人: 杜以軍;齊靜;王金寶;吳家強;張秀美
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/21
• 分類號: C12N15/21;C12N15/79;C12N15/10;A61K38/21;A61P31/14
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)中基因表達領(lǐng)域，特別涉及一種高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因，還涉及其表達蛋白的用途。

背景技術(shù)

干擾素（IFN）是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子。IFN可分為兩個型(I型和II型)，IFN-α屬于I型干擾素，是機體細胞抵抗病毒感染的第一道防線，具有三大功能：抗病毒作用、抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用。Lefevre等1990年首先克隆了豬IFN-α（pIFN-α）基因并將其成熟蛋白基因在大腸桿菌中表達，具有較強的抗病毒活性。隨后國內(nèi)外學者用腺病毒、大腸桿菌、酵母等表達了pIFN-α，對其生物學活性進行了大量研究。本課題組也曾將pIFN-α克隆入真核表達載體pVAX1^?，轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞后表達的pIFN-α活性較低，僅為1×10^6.0U/0.1mL。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome,?PRRS），俗稱豬藍耳病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus,?PRRSV）引起，病毒感染后可以導致母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感染或繼發(fā)感染。我國于1995年底爆發(fā)此病，并迅速蔓延到全國多個省份。在許多規(guī)模化豬場，PRRS陽性率很高，有的可達80%以上。自2006年以來，我國部分地區(qū)豬場發(fā)生了由PRRSV變異株導致的高致病性藍耳病。該病在臨床上以發(fā)病豬高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征，具有更高的發(fā)病率和死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴重的經(jīng)濟損失。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上問題，本發(fā)明提供了一種高效表達和高抗病毒活性的，特別是能有效抑制高致病性PRRSV的豬α干擾素基因。

本發(fā)明還提供了所述豬α干擾素基因通過分子生物學技術(shù)克隆至真核表達載體獲得的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供了所述豬α干擾素基因的制備方法。

本發(fā)明還提供了所述豬α干擾素基因表達蛋白的用途。

本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的：

一種高效表達和高抗病毒活性的豬α干擾素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

一種序列2的基因通過分子生物學技術(shù)克隆至真核表達載體獲得的重組質(zhì)粒。

一種所述的豬α干擾素基因的合成方法，包括以下步驟

1、將真核質(zhì)粒pVAX1^?改造為pMVAX1^?：

由GenBank公布的Rabbit?β-Globin?Intron?II基因序列GenBank?No:?V00882，在上游引入SstI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和EcoRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將此段基因序列通過SstI/EcoRI酶切位點插入pVAX1^?載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，提取質(zhì)粒經(jīng)篩選得到SstI/EcoRI雙酶切陽性克隆，命名為pMVAX1^?；

所述pCMV即刻早期啟動子的一段序列為：5’-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’，

所述T7啟動子序列為：5’-AATACGACTCACTATAGGG-3’；

2、構(gòu)建表達pIFN-α的重組真核質(zhì)粒pMVAX1^?-pIFN-α：

2.1設計一對擴增pIFN-α成熟蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下：

pIFN-α-Fwd：5’-TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3’，

pIFN-α-Rev：5’-GAGCTCGAGAAGCTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’，

在上游引物pIFN-α-Fwd的5’端引入EcoRI限制性內(nèi)切酶位點和Kozak序列，在下游引物pIFN-α-Rev的5’端引入XhoI限制性內(nèi)切酶位點；