[發明專利]檢測牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110084546.6
• 申請日: 2011-04-06
• 公開（公告）號: CN102181578A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 吳丹;張鶴曉;吳濤;高志強;周琦;劉來福;蒲靜;張偉;汪琳;谷強;張向東;喬彩霞;柏亞鐸;段向英;齊瑋;郭錚蕾
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

技術領域

本發明涉及檢測牛腸道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和檢測試劑盒，尤指多重RT-PCR檢測牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢測核苷酸序列和試劑盒，不僅適用于對動物組織樣本的準確檢測，還可適用于動物活體樣本（咽喉拭子、肛門拭子、糞便、血清、皰疹皮、皰疹液、眼結膜分泌物等）的檢測，可用于牛腸道病毒的國內篩查和出入境檢疫，以及牛腸道病毒和口蹄疫病毒的同時檢測和鑒別診斷等，屬于動物疫病檢測、檢驗檢疫領域。

背景技術

牛腸道病毒和口蹄疫病毒都是小RNA病毒科成員。小RNA病毒是一個極為繁雜的病毒科，可分為鼻病毒屬、口蹄疫病毒屬、腸道病毒屬、心病毒屬和甲肝病毒屬等5個屬，共200多種病毒，能引起人和動物的多種疾病，如甲肝、口蹄疫等，在醫學和獸醫學研究中均具有重大意義。

腸道病毒是脊椎動物腸道中原有的棲居者，病原性不明顯，通常引起輕度或不顯性感染，但常因侵犯其他器官而引起各種臨床綜合征，或者在一定條件下引發顯著癥狀，例如牛腸道病毒、豬腸道病毒、禽腸道病毒、人腸道病毒等等。

2005年初北京的牛場中發生牛腸道病毒感染，嚴重影響了畜牧業生產。部分牛場的產奶牛普遍（約80%）出現了嚴重腹瀉癥狀：水樣腹瀉，有泡沫，少數（10-15%）嚴重的還有鮮血，體溫變化不明顯，食欲下降，基本沒有死亡，但產奶量大幅下降（約30%）。約兩周后康復，康復后大多數奶牛的產奶量不能恢復到病前的水平，特別是日產35千克以上高產奶牛。嚴重降低了生產性能，并且還有污染奶制品的可能。據跟蹤調查，該病兩年發生一次。我們在發病的牛場中已經分離到了牛腸道病毒。

隨著豬鏈球菌2型病和高致病性藍耳病的相繼爆發，條件性致病菌／病毒對畜牧業生產和公共衛生安全方面的威脅，或者說潛在的危險也逐漸為人們所認識。因此我們認為隨著人們對牛腸道病毒認識的加深和對公共衛生安全的重視日益加強，牛腸道病毒很有可能在將來被列為法檢項目，在這種情況下我們提前針對牛腸道病毒建立快速、準確、敏感的診斷方法，進行技術儲備顯得格外重要，因此開展了牛腸道病毒快速檢測技術研究。

口蹄疫病毒可以感染偶蹄動物引起急性、熱性、接觸性傳染病，最易感染的動物是黃牛、水牛、豬、駱駝、羊、鹿等，黃羊、麝、野豬、野牛等野生動物也易感染此病。本病以牛最易感染，羊的感染率低。口蹄疫在亞洲、非洲和中東以及南美均有流行，在非流行區也有散發病例。口蹄疫發病后一般不致死，但會使病獸的口、蹄部出現大量水皰，高燒不退，使實際畜產量銳減。另外，有個別口蹄疫病毒的變種可傳染給人。因此，每次爆發后只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以絕后患。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補救措施少，被稱為畜牧業的“頭號殺手”。

牛腸道病毒與口蹄疫病毒同屬于小RNA病毒科成員，在形態結構、化學組成、部分理化性質和對環境的抵抗力方面有很多相近之處，而國外研究報道了多起牛腸道病毒與口蹄疫病毒同時分離到的病例，因此針對牛腸道病毒和口蹄疫病毒建立鑒別診斷方法也具有重大意義。

在檢驗檢疫過程中，快速、準確、敏感的診斷是檢測疫病的關鍵所在。多重PCR可以同時區別鑒定兩種或兩種以上的病原，操作也比較簡單易行，具有高效性、系統性和經濟簡便性等特點，適用于多種病原的鑒別診斷。

因此我們針對牛腸道病毒基因和口蹄疫病毒基因建立多重RT-PCR快速檢測技術，用于牛腸道病毒和口蹄疫病毒的鑒別診斷。這種檢測方法的建立將為我國出入境牛腸道病毒和口蹄疫病毒的檢驗檢疫奠定良好的技術基礎，可在各口岸和各養殖企業推廣應用，以及時檢出牛腸道病毒和口蹄疫病毒，保障公共衛生安全，保障我國牛及其產品進出口貿易的正常進行，推動外貿經濟的發展。

一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。多重PCR(multiplex?PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。