[發明專利]一種穩定聯產異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用有效

申請號：	201110084263.1	申請日：	2011-04-02
公開（公告）號：	CN102199614A	公開（公告）日：	2011-09-28
發明（設計）人：	董紅軍;戴宗杰;張延平;李寅	申請（專利權）人：	中國科學院微生物研究所
主分類號：	C12N15/53	分類號：	C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/04;C12P7/06;C12P7/04;C12P7/16;C12R1/145
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種穩定聯產異丙醇丁醇工程及其構建方法應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種穩定聯產異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

隨著能源與環境危機的日益加重，迫使人們去尋找新的方法來逐步減少對于化石資源的依賴。通過微生物利用可再生資源來生產化學品是重要的途徑之一。

異丙醇(isopropanol)是重要的化工產品和原料。主要用于制藥、化妝品、塑料、香料、涂料及電子工業上用作脫水劑及清洗劑。異丙醇作為低成本溶劑或萃取劑在工業和消費產品中的生產中廣泛應用。低品質的異丙醇還可用在汽車燃料中。在許多情況下異丙醇可代替乙醇使用。2010年我國對異丙醇的年需求總量將達到30萬噸，我國異丙醇主要用作油墨、涂料和制藥工業過程中的溶劑或萃取劑，其消費量約占異丙醇總消費量的60％。在化學中間體領域，我國異丙醇主要用于生產異丙胺、異丙醚以及一些酯類，其消費量約占異丙醇總消費量的25％。異丙醇在其他方面的應用主要包括電子工業清洗劑、汽車防凍液、消毒劑、洗滌用品、日化產品等，其消費量約占異丙醇總消費量的15％。

丁醇是一種優良的可替代汽油的生物燃料，這是因為丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不會腐蝕管道，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合，因此是一種極具潛力的新型生物燃料。同時丁醇還是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，是一種高附加值化學品，全球年需求量超過140萬噸。

1861年巴斯德首次發現細菌能夠產生丁醇，1912年魏茲曼(Weizmann)發現了一種梭菌Clostridium?acetobutylicum能夠將淀粉轉化為丙酮、丁醇及乙醇。有研究發現拜氏梭菌(Clostridium?beijerinckii)NRRL?B593和NESTE?255可以在細胞內合成大約100mM的異丙醇，其合成機理是通過一種異丙醇醇脫氫酶(又稱次級醇脫氫酶，secondary?alcohol?dehydregenase，SADH)將丙酮催化成異丙醇。

發明內容

本發明的目的是提供一種聯產異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用。

本發明所提供的工程菌，按照包括如下步驟的方法構建：將次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)整合到產丁醇梭菌的基因組中，得到的重組菌即為所述工程菌。該方法使得次級醇脫氫酶的編碼基因能夠隨著染色體的復制而復制，實現穩定表達。

所述次級醇脫氫酶具體可為如下a)或b)的蛋白質：

a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

b)將序列表中序列7的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白質：將丙酮催化成異丙醇。

所述次級醇脫氫酶的編碼基因具體可為如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)與(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA分子。

所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產丁醇梭菌的基因組中，可通過下述任一種方法實現：同源重組法、二型內含子整合法、特異位點整合法和隨機位點整合法。但不限于這幾種方法，包括任何可以在基因組中進行整合外源基因的方法。

所述同源重組方法包括使用自殺載體進行重組，也包括使用復制性質粒和線性DNA片段進行的重組方式。