[發明專利]一種穩定聯產異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201110084263.1
• 申請日: 2011-04-02
• 公開（公告）號: CN102199614A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 董紅軍;戴宗杰;張延平;李寅
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/04;C12P7/06;C12P7/04;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

1.一種工程菌的構建方法，包括如下步驟：將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產丁醇梭菌的基因組中，得到的重組菌即為所述工程菌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述次級醇脫氫酶是如下a)或b)的蛋白質：

a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

b)將序列表中序列7的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白質：將丙酮催化成異丙醇。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述次級醇脫氫酶的編碼基因為如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)與(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA分子。

4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產丁醇梭菌的基因組中，通過下述任一種方法實現：同源重組法、二型內含子整合法、特異位點整合法和隨機位點整合法。

5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產丁醇梭菌的基因組中，通過將所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到所述產丁醇梭菌的染色體中的如下位點實現：尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因位點或16SrDNA位點。

6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述產丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。

7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產丁醇梭菌的基因組中，通過將如下片段導入所述產丁醇梭菌中實現：由所述次級醇脫氫酶的編碼基因和啟動所述次級醇脫氫酶的編碼基因轉錄的啟動子組成的DNA片段；所述啟動子具體可為丙酮丁醇梭菌硫解酶啟動子；所述丙酮丁醇梭菌硫解酶啟動子的序列具體可為序列表中序列2或序列8的第287至436位；

由所述次級醇脫氫酶的編碼基因和啟動所述次級醇脫氫酶的編碼基因轉錄的啟動子組成的DNA片段的核苷酸序列具體可為序列8的第287-1498位。

8.權利要求1-7中任一所述的方法得到的工程菌。

9.根據權利要求8所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌為下述a或b或c所述的重組菌：

a、將pEK18-upp(8052)-sadh導入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因組中的重組菌；

b、將pEK18-16S(8052)-sadh導入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因組中的重組菌；

c、將pMTL009-upp-sadh導入丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)SMB009，得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到丙酮丁醇梭菌SMB009的基因組中的重組菌，如保藏號為CGMCC?No.4724的丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)SMB312。

10.權利要求9所述的工程菌在生產醇中的應用，所述醇為下述三種醇中的至少一種：丁醇、異丙醇和乙醇。