[發明專利]AaPMT和AaTRI雙基因共轉化提高三分三毛狀根中托品烷生物堿含量的方法

無效

• 申請號: 201110083462.0
• 申請日: 2011-04-02
• 公開（公告）號: CN102212548A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 開國銀;楊勝;周文濤;羅秀芹;劉源云
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發明涉及的是一種生物工程技術領域的方法，特別是一種利用雙關鍵酶基因共轉化代謝工程策略提高三分三毛狀根中托品烷生物堿含量的方法。

背景技術

托品烷生物堿(tropane?alkaloids)，又稱莨菪烷生物堿，包括：莨菪堿(hyoscyamine)、山莨菪堿(anisodamine)東莨菪堿(scopolamine)、和樟柳堿(anisodine)。托品烷生物堿的臨床各科應用越來越廣泛，它是一類作用于副交感神經系統的抗膽堿藥，具有麻醉、解痙、止痛、抗休克的功能。此外，它還具有改善微循環的作用，臨床可用于治療微循環障礙性疾病；還可用來治療青光眼等。山莨菪堿和樟柳堿除了作用域副交感神經系統。在大鼠中，還對油酸所引起的急性肺損傷和急性腎衰時腎微血管的損傷具有保護作用。但是，由于資源植物體內托品烷生物堿的產量非常低，其供給量遠遠不能滿足藥用市場的需求。尤其是東莨菪堿，由于其對中樞鎮靜比較強，在商用市場中，對東莨菪堿的需求量是莨菪堿的10倍，但在資源植物中東莨菪堿的含量又遠比莨菪堿低，所以東莨菪堿的價格遠高于莨菪堿?(高10倍多)。

野生資源植物有限，過度開采容易造成生態失衡。多年來，世界各國科學家圍繞著如何擴大托品烷生物堿的藥源問題進行了大量研究。目前，莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿和樟柳堿均可以通過化學方法合成，但化學合成的方法存在工藝流程復雜、成本高及易造成環境污染等問題；傳統育種方法所需的周期太長；細胞培養則存在托品烷生物堿含量低微及穩定性差等問題。但是毛狀根技術在近些年成為了生產植物次生代謝物的一種比較新的途徑。通過發根農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)侵染植物而生成的毛狀根具有很多優點：比如毛狀根具有藥用植物遺傳背景，所以具有相似的代謝特征，能夠穩定生產次生代謝物，有時甚至比植株本身的含量更高；同時毛狀根生長速度快，不需外源激素，在連續繼代培養的情況下能保持遺傳性穩定。毛狀根的可以通過生物反應器進行大規模的培養；還可以再生為完整的植株，由發根再生的植株同樣具有遺傳穩定性。

藥用植物三分三(Anisodus?acutangulus)，為茄科多年生草本植物，主要分布于我國云南西北部麗江。通過高效液相色譜檢測，其根部含有大量的托品烷生物堿，據報道野生三分三干燥品總生物堿含量高達1.2％，所含生物堿含量比世界上一些常用的茄科植物如顛茄、莨菪曼陀羅等均高的多，且三分三所含生物堿絕大部分是莨菪烷類生物堿。三分三作為解痙鎮痛的中草藥在云南民間使用已有三四百年的悠久歷史，然而由于大量采摘，野生資源已十分匱乏。因此，三分三是一種既重要又匱乏的產莨菪烷生物堿的優質資源植物。

目前，莨菪生物堿的基本代謝途徑已經研究得比較清楚。與其他產莨菪烷生物堿植物如莨菪等相似，三分三中的莨菪堿也是由精氨酸和鳥氨酸經腐胺(Putrescine)衍生而來的。在整個莨菪烷生物堿合成過程中，腐胺N-甲基轉移酶(Putrescine?N-methyltransferase，PMT)和托品酮還原酶I(Tropinone?reductase?I，TRI)是兩個關鍵的催化酶，是托品烷生物堿代謝工程的重要靶點。它們通過一系列的催化作用最終生成莨菪醇，使得莨菪醇沿主路途徑最終生成目標活性物質莨菪生物堿。將上述的兩個關鍵酶基因AaPMT和AaTRI共轉化三分三，將打破托品烷生物堿生物合成途徑的瓶頸效應，獲得高產托品烷生物堿的三分三毛狀根或植株，為商業化大量生產托品烷生物堿提供了可能，更為藥品價格的降低提供了可能。迄今為止，國內外從三分三中分離克隆雙關鍵酶基因并且通過共轉化策略來提高三分三毛狀根中托品烷生物堿含量的研究尚鮮見報道。因此，本發明在實際解決托品烷生物堿藥源緊缺性的問題上具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于克服常規技術獲得托品烷生物堿中的不足，提供一種有效提高三分三毛狀根中托品烷生物堿含量的方法。

本發明還提供了實現上述方法的重組載體。

一種用于提高脫品烷生物堿含量的重組載體，含有腐胺N-甲基轉移酶基因和托品酮還原酶I基因。

本發明應用雙關鍵酶基因共轉化策略提高三分三毛狀根托品烷生物堿含量的方法，采用基因工程方法，將雙關鍵酶基因(AaPMT，AaTRI)導入三分三外植體中，通過發根農桿菌的侵染獲得了高產托品烷生物堿的三分三毛狀根株系。