[發明專利]一種生產豬α-干擾素的純化方法

無效

• 申請號: 201110082331.0
• 申請日: 2011-04-01
• 公開（公告）號: CN102732587A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 王偉穎;閆亮亮;劉桂蘭
• 申請（專利權）人: 瑞普（天津）生物藥業有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/56;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/16;C12R1/84
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技術領域

本發明屬于生物制劑領域，更具體地說，是涉及一種用于生產豬α-干擾素的純化方法。

背景技術

干擾素(IFN)是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質，具有調節機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機體防御系統的重要組成部分。IFN的抗病毒活性是通過宿主細胞而間接完成的，并具有嚴格的種屬特異性及選擇性。根據其來源和結構，IFN可分為α、β、γ三種類型，近年來，還發現了ω、τ等類型的干擾素。IFN-α主要由單核細胞產生；IFN-β主要由纖維母細胞產生，血管內皮細胞也可產生；IFN-γ由抗原及PH等有絲分裂原刺激T細胞后產生，此外，NK細胞也可產生。IFN-τ是反芻動物孕體附植時滋養層細胞分泌的特有的妊娠識別信號因子，在妊娠識別中發揮著重要的作用。

豬干擾素是被研究最早的動物干擾素之一，20世紀80年代就有豬干擾素的相關報道。近年來，對豬干擾素的誘導條件和理化活性有了進一步的研究，同時對豬白細胞干擾素進行了大量的臨床試驗。研究表明，它對豬的許多病毒性傳染病，如流行性腹瀉、豬瘟、傳染性胃腸炎等，以及對牛病毒性腹瀉、小鵝瘟，羔羊腹瀉等都具有不錯的療效，試驗證實豬干擾素與牛羊等動物之間存在交叉活性。最近幾年，豬干擾素α、β、γ基因的分子克隆與序列分析獲得成功。

目前，生產動物用的干擾素(如豬干擾素)的常見方法有生物來源提取法、基因重組技術法等。其中利用重組菌株表達生產干擾素，具有無污染、安全性高、純度高、生物活性高、成本低等優點，從而進入大規模的產業化生產階段，并廣泛應用于臨床。目前已成為當代生物技術領域中應用較為廣泛的細胞激活素。

但是，利用重組菌株表達生產干擾素，在后期的分離純化過程中一般都要使用價值昂貴的單抗柱，純度才能達到95％以上；而目前國產的單抗柱，無論在產量和質量上，都不能滿足廠家的需要，而只能高價進口，增加生產成本。因此，目前需要一種經濟、快速、高效地的純化方法，以用于生產干擾素。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中存在的不足，提供一種經濟、快速、高效的豬α-干擾素純化方法。

因此，本發明目的在于提供一種豬α-干擾素純化方法，步驟包括：

(1)重組菌株進行發酵；

(2)6000rpm，15min離心發酵液取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；

(3)用醋酸調節濃縮液的pH至5，并過陽離子層析柱(CM?Sepharose柱層析)，收集0.45mol/L的目標洗脫峰；

(4)加入硫酸銨30％(W/V)至稍混濁，6000rpm，15min離心取上清；

(5)用凝膠過濾法先去熱原，用50mmol/L，pH5.5的醋酸緩沖液平衡，上樣。過Sephacryl?S-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰；

(6)將充分浸泡后的Sephadex?G-75凝膠裝入色譜柱中，用凝膠過濾法去熱原，用10mmol/L、pH7.0的PBS緩沖液平衡，上樣。過Sephadex?G-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液；置于4℃冰箱保存。

本發明的有益效果是：

本發明提供的重組菌株表達干擾素的后續純化方法，無需使用價格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的污染，縮短了純化時間，降低了生產成本，最終可得到純度高于97％的干擾素原液，在工業生產中應用將會帶來良好的經濟效益。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的描述。

實施例1：重組酵母表達豬α-干擾素的純化

(1)重組菌株進行發酵；

(2)6000rpm，15min離心發酵液取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；

(3)用醋酸調節濃縮液的pH至5，并過陽離子層析柱(CM?Sepharose柱層析)，收集0.45mol/L的目標洗脫峰；

(4)加入硫酸銨30％(W/V)至稍混濁，6000rpm，15min離心取上清；

(5)先去熱原，用50mmol/L，pH5.5的醋酸緩沖液平衡，過Sephacryl?S-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰，其中通過凝膠過濾法進行去熱原；

(6)將充分浸泡后的Sephadex?G-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7.0的PBS緩沖液，過Sephadex?G-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液，其中通過凝膠過濾法進行去熱原；置于4℃冰箱保存。