[發(fā)明專利]基于血脂蛋白快速分離的脂質(zhì)熒光檢測(cè)技術(shù)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110081034.4
• 申請(qǐng)日: 2011-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN102735763A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱海波;楊柳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/14
• 代理公司: 北京三高永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11138
• 代理人: 江崇玉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種完善的基于蛋白快速分離(FPLC)和熒光檢測(cè)技術(shù)的血清脂蛋白分離和脂質(zhì)含量測(cè)定技術(shù)平臺(tái)，該技術(shù)平臺(tái)可用于人類高脂血癥及各種高脂血癥模式動(dòng)物血清脂蛋白譜的繪制和脂蛋白中脂質(zhì)含量的檢測(cè)，觀察受試化合物對(duì)高脂血癥動(dòng)物血清脂蛋白譜和脂質(zhì)含量的影響。

技術(shù)背景

快速蛋白分離技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種高效便捷的蛋白分離技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)將液相系統(tǒng)與不同特性的分離柱聯(lián)合起來(lái)，根據(jù)不同的需要分離目的蛋白。在整個(gè)分離系統(tǒng)中處于核心地位的是針對(duì)待分離蛋白特性所選擇的分離柱。在本技術(shù)平臺(tái)中，我們針對(duì)所關(guān)注的極低密度、低密度、高密度脂蛋白的大小之間存在差異，選擇了Superdex?200?10/300GL凝膠分離柱，該分離柱具有高分辨率、省時(shí)和高回收率等特性，適用于分離分子量在1×10⁴-6×10⁵之間的球蛋白，血清脂蛋白中的極低密度和低密度脂蛋白為分子量較大的蛋白，大小主要分布在3000?000Da左右，而高密度脂蛋白則相對(duì)小一些，主要分布在175-500?000Da之間，故采用該凝膠分離柱能較好地將極低密度和低密度脂蛋白與高密度脂蛋白分開并對(duì)蛋白進(jìn)行收集，后續(xù)可對(duì)蛋白含量的變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，還可以對(duì)分離后脂蛋白內(nèi)的脂質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，該方法尤其適用于觀察調(diào)血脂藥物對(duì)動(dòng)物脂蛋白含量的影響，快速篩選具有調(diào)血脂作用的先導(dǎo)化合物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于建立基于蛋白快速分離和熒光檢測(cè)技術(shù)的血清脂蛋白分離和脂質(zhì)含量測(cè)定技術(shù)。

本發(fā)明的目的之二在于利用該技術(shù)研究人類和不同種屬高脂血癥模式動(dòng)物脂蛋白譜。

本發(fā)明的目的之三在于觀察調(diào)血脂受試化合物對(duì)高脂血癥模式動(dòng)物血清脂蛋白譜和脂質(zhì)含量的影響。

因此，為了完成本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明主要涉及建立基于蛋白快速分離和熒光檢測(cè)技術(shù)的血清脂蛋白譜和各脂蛋白組分中脂質(zhì)含量的研究方法。

本技術(shù)平臺(tái)中涉及的原理：

蛋白快速分離：本平臺(tái)采用凝膠過(guò)濾色譜柱，根據(jù)極目的蛋白大小不同對(duì)血清中極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度(HDL)脂蛋白進(jìn)行分離。

總膽固醇與膽固醇的檢測(cè)：

甘油三酯的檢測(cè)：

Nile?Red+甘油三酯→485nm激發(fā)538nm產(chǎn)生熒光

本發(fā)明基于血脂蛋白快速分離的脂質(zhì)熒光檢測(cè)方法：包括如下步驟：

A.對(duì)分離柱定性：可知不同物質(zhì)隨著分子量的減少，其保留體積逐漸變大，不同大小物質(zhì)的保留體積不同，將未知物質(zhì)的保留體積與這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作對(duì)比從而對(duì)對(duì)位未知物的大小進(jìn)行推測(cè)；

B.脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品保留體積的確定；

C.FPLC樣品的準(zhǔn)備：高速離心將待測(cè)血液樣品中殘留的血細(xì)胞去除，同時(shí)去除血清中游離的脂質(zhì)；經(jīng)過(guò)過(guò)濾后能除去一些大顆粒物質(zhì)，

D.血清脂蛋白快速分離；

E.血清脂蛋白亞組分的收集；

F.AmplexRed法檢測(cè)總膽固醇、游離膽固醇，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

G.AmplexRed法檢測(cè)樣品血清各收集管中總膽固醇、游離膽固醇；

H.利用公式“膽固醇酯濃度＝總膽固醇濃度-游離膽固醇濃度”，計(jì)算膽固醇酯的濃度。

步驟H還可以是Nile?Red法檢測(cè)樣品血清FPLC各組分中甘油三酯。

步驟A中分離柱的定性的步驟是：

1)將Gel?Filtration?Calibration?Kits中6種標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書配置成一定濃度：Ovalbumin?4mg/ml，Conalbumin?3mg/ml，Aldolase?4mg/ml，F(xiàn)erritin?1.2mg/ml，Thyroglobulin?5mg/ml，Blue?Dextran?2000?1mg/ml。

2)取各樣品800微升，10000g離心10分鐘，0.22微米濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后樣品收集至1毫升注射器中(200微升/支，每個(gè)樣品3支)，用于上樣。

3)標(biāo)準(zhǔn)品FPLC分離

(a)分離條件：進(jìn)樣體積：100微升；流速：0.3ml/min；信號(hào)采集波長(zhǎng)：280納米。

(b)分離：用洗脫液對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行平衡(3個(gè)柱體積)，將樣品進(jìn)入上樣環(huán)中，進(jìn)樣，0.3ml/min洗脫。

(c)統(tǒng)計(jì)：統(tǒng)計(jì)Blue?Dextran?2000和其它5種蛋白保留體積，計(jì)算平均值。

步驟B中脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品保留體積的確定的步驟是：