[發明專利]基于血脂蛋白快速分離的脂質熒光檢測技術

無效

• 申請號: 201110081034.4
• 申請日: 2011-03-31
• 公開（公告）號: CN102735763A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 朱海波;楊柳
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥物研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/14
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 江崇玉

1.一種基于血脂蛋白快速分離的脂質熒光檢測方法：包括如下步驟：

A.對分離柱定性：可知不同物質隨著分子量的減少，其保留體積逐漸變大，不同大小物質的保留體積不同，將未知物質的保留體積與這些標準物質作對比從而對對位未知物的大小進行推測；

B.脂蛋白標準品保留體積的確定；

C.FPLC樣品的準備：高速離心將待測血液樣品中殘留的血細胞去除，同時去除血清中游離的脂質；經過過濾后能除去一些大顆粒物質，

D.血清脂蛋白快速分離；

E.血清脂蛋白亞組分的收集；

F.AmplexRed法檢測總膽固醇、游離膽固醇，繪制標準曲線；

G.AmplexRed法檢測樣品血清各收集管中總膽固醇、游離膽固醇；

H.利用公式“膽固醇酯濃度＝總膽固醇濃度-游離膽固醇濃度”，計算膽固醇酯的濃度。

2.根據權利要求1的方法，其特征在于，步驟H還可以是Nile?Red法檢測樣品血清FPLC各組分中甘油三酯。

3.根據權利要求1的方法，其特征在于，步驟A中分離柱的定性的步驟是：

1)將Gel?Filtration?Calibration?Kits中6種標準品按說明書配置成一定濃度：Ovalbumin?4mg/ml，Conalbumin?3mg/ml，Aldolase?4mg/ml，Ferritin?1.2mg/ml，Thyroglobulin?5mg/ml，Blue?Dextran?2000?1mg/ml；

2)取各樣品800微升，10000g離心10分鐘，0.22微米濾膜過濾，過濾后樣品收集至1毫升注射器中(200微升/支，每個樣品3支)，用于上樣；

3)標準品FPLC分離

(a)分離條件：進樣體積：100微升；流速：0.3ml/min；信號采集波長：280納米；

(b)分離：用洗脫液對系統進行平衡(3個柱體積)，將樣品進入上樣環中，進樣，0.3ml/min洗脫；

(c)統計：統計Blue?Dextran?2000和其它5種蛋白保留體積，計算平均值。

4.根據權利要求1的方法，其特征在于，步驟B中脂蛋白標準品保留體積的確定的步驟是：

1)取已知濃度的VLDL(0.60mg/ml)、LDL(1.55mg/ml)、HDL(2.01mg/ml)各800微升，10000g離心10分鐘，0.22微米濾膜過濾，過濾后樣品收集至1毫升注射器中(200微升/支，每個樣品3支)，用于上樣；

2)標準品FPLC分離

(a)分離條件：進樣體積：100微升；流速：0.3ml/min；信號采集波長：280納米；

(b)分離：用洗脫液對系統進行平衡(3個柱體積)，將樣品進入上樣環中，進樣，0.3ml/min洗脫；

(c)統計：統計三種蛋白保留體積，計算平均值。

5.根據權利要求1的方法，其特征在于，步驟D中血清脂蛋白快速分離的條件為

(a)分離條件：進樣體積：100微升；流速：0.3ml/min；接樣體積：0.5ml，信號采集波長：280納米；

(b)分離：用洗脫液對系統進行平衡(3個柱體積)，將血清樣品進入上樣環中，進樣，0.3ml/min洗脫，洗脫至4ml時開始收集樣品，0.5ml/管；

(c)統計：通過對各峰面積進行積分統計。

6.根據權利要求1的方法，其特征在于，步驟F中血清脂蛋白亞組分的收集條件為：FPLC洗脫至4ml時開始收集樣品，0.5ml/管，將洗脫組分轉移至0.5mlEP管中，根據FPLC譜圖中各洗脫部分序號對貯存管進行編號，4度保存，以備后續檢測之用。