[發明專利]一種微生物轉化制備(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法

在審

• 申請號: 201110081009.6
• 申請日: 2011-04-01
• 公開（公告）號: CN102732579A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 沈文和;歐志敏;車大慶
• 申請（專利權）人: 浙江九洲藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P13/02
• 分類號: C12P13/02;C12N1/18;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
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1.一種微生物轉化制備(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法，其特征在于，所述方法是以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮為底物，以釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）CGMCC?No.?2266發酵獲得的含酶菌體細胞為生物催化劑，進行轉化反應制得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的方法為：以pH?5.0~8.0的磷酸鹽緩沖液為反應溶劑，以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮為底物、以釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）CGMCC?No.?2266發酵獲得的含酶菌體細胞為生物催化劑，于25~45?℃下轉化反應12~72小時，反應結束后，轉化液經分離純化得到所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述底物在反應體系中的初始終濃度為0.1~1?mmol/L。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的反應體系中還可以添加有終濃度為5~20%的乙醇。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的含酶菌體細胞用量以細胞干重計為1~20?g/g底物。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的含酶菌體細胞按照以下方法制備：將釀酒酵母CGMCC?No.?2266接種至發酵培養基中，搖床轉速為150~200?r/min，26~35?℃下培養18~30?h，將發酵液離心，制得含酶菌體細胞。

7.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇分離純化方法如下：反應結束后，將轉化液4000?r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，取濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的方法按照以下步驟進行：

(1)斜面培養：將釀酒酵母CGMCC?No.?2266接種到斜面培養基，26~35?℃培養4~6天得菌體斜面；

(2)種子培養：從菌體斜面取一接種環菌體轉接到種子培養基，搖床轉速為150~200?r/min，26~35℃培養18~26?h得種子液；

(3)發酵培養：取種子液，以體積分數10~20%的接種量接種于發酵培養基中，搖床轉速為150~200?r/min，26~35℃培養18~30?h，將發酵液離心分離得到所述含酶菌體細胞；

(4)生物轉化：在pH?5.0~8.0的磷酸鹽緩沖液中，添加終濃度為5~20%的乙醇作為輔助底物，加入終濃度為0.1~1?mmol/L的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮為底物，以及相當于細胞干重質量為(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮1~20倍的含酶菌體細胞，25~45?℃下轉化反應12~72小時，反應結束制得轉化液；

(5)分離純化：轉化反應結束后，將轉化液于4000?r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

9.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行：

(1)斜面培養：將釀酒酵母CGMCC?No.?2266接種到斜面培養基，26~35℃培養4~6天得菌體斜面；所述的斜面培養基終濃度組成為：麥芽汁5~15?g/L，酵母粉2~4?g/L，蛋白胨4~6?g/L，葡萄糖7~12?g/L，瓊脂15~25?g/L，自然pH值，溶劑為水；?

(2)種子培養：從菌體斜面取一接種環菌體轉接到種子培養基，26~35?℃，搖床轉速為150~200?r/min，培養18~26?h得種子液；所述的種子培養基終濃度組成為：葡萄糖26~32?g/L，酵母粉2~4?g/L，硫酸銨3~6?g/L，無水MgSO₄?0.2~0.4?g/L，K₂HPO₄·3H₂O?0.5~1.5?g/L，KH₂PO₄?0.6~1.5?g/L，用NaOH或HCl溶液調整液體培養基的pH值為7.0，溶劑為水；

(3)發酵培養：取種子液，以體積分數為10~20%的接種量接種于發酵培養基中，培養溫度為26~35?℃，搖床轉速為150~200?r/min，培養18~30?h得到含有含酶菌體細胞的發酵液，離心分離得到所述含酶菌體細胞；所述發酵培養基終濃度組成為：葡萄糖26~32?g/L，酵母粉2~4?g/L，硫酸銨3~6?g/L，無水MgSO₄?0.2~0.4?g/L，K₂HPO₄·3H₂O?0.5~1.5?g/L，KH₂PO₄?0.6~1.5?g/L，用NaOH或HCl溶液調整液體培養基的pH值為7.0，溶劑為水；

(4)生物轉化：在pH?5.0~8.0的磷酸鹽緩沖液中，加入終濃度為0.1~1?mmol/L的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，添加終濃度為5~20%的乙醇作為輔助底物，以及以相當于細胞干重質量為(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮1~20倍的含酶菌體細胞，于25~45?℃下轉化反應12~72小時得轉化液；

(5)分離純化：反應結束后，將轉化液于4000?r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，取濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。