[發明專利]一種增強L-苯丙氨酸合成代謝途徑的方法

無效

• 申請號: 201110073090.3
• 申請日: 2011-03-25
• 公開（公告）號: CN102191237A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 吳偉斌;黃欽耿;施巧琴;黃祥峰;翁雪清;趙燕玉;吳松剛
• 申請（專利權）人: 福建省麥丹生物集團有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12N1/21
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 翁素華

【技術領域】

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種增強L-苯丙氨酸合成代謝途徑的方法。

【背景技術】

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人體必須的氨基酸之一，廣泛應用于食品、飼料、醫藥和化妝品等領域，尤其是低熱量、高甜度的二肽甜味劑阿斯巴甜(Aspaname)應用的日益廣泛，作為合成阿斯巴甜兩種原料之一的L-苯丙氨酸的市場需求量迅速增加。另外，L-苯丙氨酸也是抗腫瘤藥物和氨基酸輸液制劑的必需原料，隨著其在醫藥領域的不斷開發，需求量也將不斷增加。

國內外L-苯丙氨酸的生產方法主要有水解抽提法、化學合成法、酶法和發酵法這4種。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量較低，水解抽提法很少使用；化學合成法的工藝復雜，成本較高，在國外基本上被酶法和發酵法取代；但由于底物和酶的價格較高且來源有限，酶法應用也受到限制；由于微生物直接發酵法可利用廉價且易得的原料又可在常溫常壓下進行，是目前國內外生產L-苯丙氨酸的主流方法，具有較大的競爭優勢。但是因L-苯丙氨酸等終產物對野生菌株體內的芳香氨基酸合成代謝途徑上的關鍵酶有著強烈的反饋抑制作用，使其細胞不能大量蓄積苯丙氨酸，因此若要進行實際發酵生產，就必須改造野生菌株，解除其代謝調控，使得代謝終產物能過量蓄積。

傳統的菌株選育是從自然界中篩選有產酸能力的菌株，并建立其培養條件開始的。但該方法所能積累的氨基酸種類有限，后來在確立突變技術和闡明氨基酸合成系統調節機制的基礎上發展為營養缺陷變異株、抗藥性菌株的選育，但是采用常規誘變育種的方法，盲目性大，工作量繁重，不能增加基因的數量，且突變株一般都攜帶營養缺陷，產量進一步提高受到限制。

80年代中期，隨著載體和受體系統的構建及基因重組等基因工程技術的發展，開始應用基因工程的方法對生化反應的代謝網絡進行調節，對細胞的酶、轉運及調控體系進行修飾，主要包括消除導致副反應產品產生的酶，解除對變構酶的調控，增加或抑制代謝途徑上特定基因的表達以及導入外源基因等方法。

通過對大腸桿菌L-苯丙氨酸代謝途徑進行調控來構建L-苯丙氨酸生產菌株的研究在國外開展廣泛，并取得不少成績。

sugimoto等將L-苯丙氨酸生物合成酶系的基因放到溫控啟動子的質粒上，導入大腸桿菌，通過溫度變化調節代謝產酸。1985年，Ozaki等人將抗苯丙氨酸類似物的谷氨酸棒桿菌上編碼CM和PD的基因克隆進Pce53質粒，再導回親本，發現其酸產量提高50％；美國的Monsanto公司借著基因工程技術改良大腸桿菌發酵生產L-苯丙氨酸，產酸高達45g/L，并已大規模生產，是世界上最大的L-苯丙氨酸生產企業。而國內起步較晚，1994年中國醫科大學生物技術中心的史燕東等將tyrB基因克隆質粒導入不同的宿主菌，得到產酸量提高的菌株；1999年，復旦大學范長勝等通過將關鍵酶基因aroG、pheA進行串聯表達來構建生產菌株，也大幅度地提高了工程菌的發酵產量，但國內發酵產酸率底，都未達到工業化需求水平，待進一步改良苯丙氨酸生產菌。

大腸桿菌直接發酵法合成L-苯丙氨酸，生物合成途徑分為共同途徑和分支途徑，共同途徑為分支途徑提供前體物質。以葡萄糖為起始物經赤蘚糖-4-磷酸(Erythrose-4-phosphate，E4P，五碳糖磷酸途徑的中間產物)和糖酵解過程的中間產物——磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol?pyruvate，PEP)二者縮合形成一個七碳酮糖開鏈磷酸化合物，稱為3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-α-arobinoheptulosonate-7-phosphate，DAHP)。這是芳香族氨基酸生物合成的共同代謝途徑，也是決定其產率和產量的關鍵步驟。因此，在大腸桿菌L-苯丙氨酸生物合成中，DAHP是L-苯丙氨酸生物合成過程中第一個也是最重要的代謝中間物，能否把中心代謝流有效地導向DAHP的合成是決定芳L-苯丙氨酸生物合成產量高低的決定因素。催化這一關鍵反應的酶稱之為脫氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶(DS)，是分別由aroF、aroG和aroH三個基因編碼的三個同功酶，分別受酩氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反饋抑制，同時DAHP合成酶還受到苯丙氨酸和酪氨酸的協同抑制。

共同途徑之后，分支酸是芳香族氨基酸合成途徑的分支點，在分支酸以后又分為兩條途徑，其中一條形成苯丙氨酸和酪氨酸，另一條形成色氨酸。