[發(fā)明專利]一種增強L-苯丙氨酸合成代謝途徑的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110073090.3
• 申請日: 2011-03-25
• 公開（公告）號: CN102191237A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發(fā)明（設計）人: 吳偉斌;黃欽耿;施巧琴;黃祥峰;翁雪清;趙燕玉;吳松剛
• 申請（專利權）人: 福建省麥丹生物集團有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12N1/21
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 翁素華

1.一種增強L-苯丙氨酸合成代謝途徑的方法，其特征在于：采用Red系統(tǒng)依次對L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中的ptsG基因、pykA基因及pykF基因進行敲除；然后將工程質粒Mdphe-2植入ptsG基因、pykA基因及pykF基因均已敲除的該工程宿主菌內以構建新的L-苯丙氨酸基因工程菌；最后對該新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性及產酸進行驗證。

2.如權利要求1所述的一種增強L-苯丙氨酸合成代謝途徑的方法，其特征在于：包括以下幾個步驟：

步驟一：對L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中的ptsG基因進行敲除：首先構建ptsG基因的敲除組件，具體操作是取pKD13質粒作為模板，并合成一對含有ptsG基因的短同源片段序列作為PCR的引物對，接著進行PCR擴增，PCR擴增結束后，于冰中放置15min后，對擴增產物用Dpn?I酶于37℃下處理1h，酶處理結束后再于冰中放置5min，之后進行電泳回收，并將回收片段進行測序驗證，序列結果顯示其與理論相符，即ptsG基因的敲除組件構建成功；接著將Red系統(tǒng)中編碼有Red重組酶的pKD46質粒植入工程宿主菌后，把該工程宿主菌制備成高效率的電轉化感受態(tài)細胞；然后將ptsG基因的敲除組件導入該感受態(tài)細胞混勻后進行工程宿主菌的敲除操作，并對其進行誘導以丟失pKD46質粒；之后對工程宿主菌中ptsG基因缺失進行驗證及抗性基因的消除，最終獲得ptsG基因缺失的工程宿主菌，并命名為MD-ptsG^-；

步驟二：對步驟一獲得的工程宿主菌MD-ptsG^-中的pykA基因進行敲除：首先構建工程宿主菌MD-ptsG^-中pykA基因的敲除組件，具體操作是取pKD13質粒作為模板，并合成一對含有pykA基因的短同源片段序列作為PCR的引物對，接著進行PCR擴增，PCR擴增結束后，于冰中放置15min后，對擴增產物用Dpn?I酶于37℃下處理1h，酶處理結束后再于冰中放置5min，之后進行電泳回收，并將回收片段進行測序驗證，序列結果顯示其與理論相符，即pykA基因的敲除組件構建成功；接著將Red系統(tǒng)中編碼有Red重組酶的pKD46質粒植入工程宿主菌MD-ptsG^-后，把該工程宿主菌制備成高效率的電轉化感受態(tài)細胞；然后將pykA基因的敲除組件導入該感受態(tài)細胞混勻后進行工程宿主菌的敲除操作，并對其進行誘導以丟失pKD46質粒；之后對工程宿主菌MD-ptsG^-中pykA基因缺失進行驗證及抗性基因的消除，最終獲得ptsG基因與pykA基因均缺失的工程宿主菌，命名為MD-ptsG^-+pykA^-；

步驟三：對工程宿主菌MD-ptsG^-+pykA^-中的pykF基因進行敲除：首先構建工程宿主菌MD-ptsG^-+pykA^--中pykF基因的敲除組件，具體操作是取pKD13質粒作為模板，并合成一對含有pykF基因的短同源片段序列作為PCR的引物對，接著進行PCR擴增，PCR擴增結束后，于冰中放置15min后，對擴增產物用Dpn?I酶于37℃下處理1h，酶處理結束后再于冰中放置5min，之后進行電泳回收，并將回收片段進行測序驗證，序列結果顯示其與理論相符，即pykF基因的敲除組件構建成功；接著將Red系統(tǒng)中編碼有Red重組酶的pKD46質粒植入工程宿主菌MD-ptsG^-+pykA^--后，把該工程宿主菌制備成高效率的電轉化感受態(tài)細胞；然后將pykF基因的敲除組件導入該感受態(tài)細胞混勻后進行工程宿主菌的敲除操作，并對其進行誘導以丟失pKD46質粒；之后對工程宿主菌MD-ptsG^-+pykA^--中pykF基因缺失進行驗證及抗性基因的消除，最終獲得ptsG基因、pykA基因及pykF基因均缺失的工程宿主菌，命名為MD-ptsG^-+pykA^-+pykF^-；

步驟四：將工程質粒Mdphe-2植入工程宿主菌MD-ptsG^-+pykA^-+pykF^-當中進行表達，以完成新的L-苯丙氨酸基因工程菌的構建；并對該新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性及產酸進行驗證。

3.如權利要求1或2所述的一種增強L-苯丙氨酸合成代謝途徑的方法，其特征在于：所述工程宿主菌為大腸桿菌。