[發明專利]通過敲除abrB基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法

無效

• 申請號: 201110071211.0
• 申請日: 2011-03-24
• 公開（公告）號: CN102174558A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 陸兆新;曹國強;呂鳳霞;別小妹;張充;鐘蕾
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/125
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發明涉及通過敲除abrB基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）是目前公認的安全微生物之一，其抗菌代謝產物豐富多樣，尤其是脂肽類抗菌物質，不僅抗菌譜廣而且還具有生物表面活性劑的功能，因此不僅可以在農業上用于進行生物防治，而且在工業和環境保護上也有著廣泛的應用。

枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）ATCC?9943是一種可以分泌?surfactin，fengycin等抗菌肽物質的枯草芽孢桿菌（Valérie?Leclère,?Romain?Marti,?Max?Béchet.?The?lipopeptides?mycosubtilin?and?surfactin?enhance?spreading?of?Bacillus?subtilis?strains?by?thei

目前，世界范圍內，提高其產量的方法主要是篩選優良菌株，以及優化發酵條件，而很少采用分子生物學技術對菌種進行改良的方法來提高其產抗菌物質的產量。但隨著對抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已經逐漸開始采用分子生物學技術，通過改造其合成分泌中信號通路等方法來對原始菌種進行基因改良，從而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。

abrB基因（Gene?ID:?937009），作為枯草芽孢桿菌中的一種調控蛋白，在枯草芽孢桿菌各種生理代謝過程中發揮著重要的作用，相關研究表明，AbrB蛋白對于抗菌物質的合成具有一定的阻礙作用。

本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC?9943為出發菌株，以大腸桿菌克隆載體pGEM-T為骨架構建一個基因敲除載體pAbrB-Cm，利用同源重組原理，通過雙交換過程敲除枯草芽孢桿菌ATCC?9943基因組中abrB基因的方法構建了一個高產抗菌肽菌株FMB?29。

發明內容

技術問題

本發明的目的是利用分子生物學技術，構建abrB基因敲除載體，經過電轉化通過同源重組將枯草芽孢桿菌ATCC?9943基因組中abrB基因敲除，從而構建一種高產抗菌肽的枯草芽孢桿菌菌株FMB?29。

技術方案

1、通過敲除abrB基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產量的方法，其特征在于：

（1）abrB基因敲除載體pAbrB-Cm的構建

根據枯草芽孢桿菌abrB基因設計引物AbrB5’-F和AbrB5’-R，以枯草芽孢桿菌ATCC?9943基因組DNA為模板PCR擴增部分5’端abrB基因及其上游基因，獲得500bp基因片段；根據枯草芽孢桿菌abrB基因設計引物AbrB3’-F和AbrB3’-R，以枯草芽孢桿菌ATCC?9943基因組DNA為模板PCR擴增部分3’端abrB基因及其下游基因，獲得500bp基因片段；根據pHCMC04的DNA設計引物CM-F和CM-R，以pHCMC04質粒為模板PCR擴增包括啟動子和終止子的氯霉素抗性基因表達框，獲得1500bp基因片段；擴增得到的三個基因分別克隆至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌（Escherichia?coli）DH5a，經驗證、測序正確后，分別命名為pabrB5’-T、pabrB3’?-T、pCM-T，于-20℃條件下保存備用；