[發(fā)明專利]通過敲除abrB基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110071211.0
• 申請日: 2011-03-24
• 公開（公告）號: CN102174558A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸兆新;曹國強(qiáng);呂鳳霞;別小妹;張充;鐘蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/125
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.通過敲除abrB基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，其特征在于：

（1）abrB基因敲除載體pAbrB-Cm的構(gòu)建

設(shè)計引物AbrB5’-F和AbrB5’-R，以枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）ATCC?9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增部分5’端abrB基因及其上游基因，獲得500bp基因片段；設(shè)計引物AbrB3’-F和AbrB3’-R，以枯草芽孢桿菌ATCC?9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增部分3’端abrB基因及其下游基因，獲得500bp基因片段；設(shè)計引物CM-F和CM-R，以pHCMC04質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增包括啟動子和終止子的氯霉素抗性基因表達(dá)框，獲得1500bp基因片段；擴(kuò)增得到的三個基因分別克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia?coli）DH5a，經(jīng)驗證、測序正確后，分別命名為pabrB5’-T、pabrB3’?-T、pCM-T，于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

pabrB5’-T用EcoRI/XbaI雙酶切后獲得abrB5’片段，與經(jīng)過相同雙酶切處理的pGEM-T載體，用T4?DNA連接酶連接，構(gòu)建pGEM-abrB5’載體，酶切驗證正確后于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

pabrB3’-T用XbaI/SphI雙酶切后獲得abrB3’片段，與經(jīng)過相同雙酶切處理的pGEM-?abrB5’載體，用T4?DNA連接酶連接，構(gòu)建pGEM-abrB載體，酶切驗證正確后于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

pCM-T用XbaI酶切后獲得CM片段，與經(jīng)過相同酶切處理的pGEM-abrB載體，用T4?DNA連接酶連接，構(gòu)建abrB基因敲除載體pAbrB-Cm，酶切驗證正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用于下一步轉(zhuǎn)化；

（2）FMB?29突變菌株的構(gòu)建

以枯草芽孢桿菌ATCC?9943制備感受態(tài)細(xì)胞，采用電轉(zhuǎn)化方法，將獲得的abrB基因敲除載體pAbrB-Cm轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌ATCC?9943，在基因組abrB位點發(fā)生雙交換，CM抗性平板上篩選得到氯霉素抗性菌株，命名為FMB?29；該菌株的abrB基因被氯霉素抗性基因所取代，成為缺失了abrB基因的突變菌株，即為所得到的菌株。

2.權(quán)利要求1所述方法獲得的敲除abrB基因菌株FMB?29。

3.權(quán)利要求2所述敲除abrB基因菌株FMB?29在生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌肽中的應(yīng)用。

4.權(quán)利要求2所述敲除abrB基因菌株FMB?29生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)品。