[發(fā)明專利]萊茵衣藻分泌型表達載體及分泌型表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110070784.1
• 申請日: 2011-03-23
• 公開（公告）號: CN102181471A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設計）人: 胡章立;吳錦霞;陳俊
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12R1/89
• 代理公司: 深圳市君勝知識產(chǎn)權代理事務所 44268
• 代理人: 楊宏

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及萊茵衣藻分泌型表達載體及分泌型表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法。

背景技術

萊茵衣藻是一種單細胞真核藻，屬于綠藻門等鞭毛綱團藻目衣藻屬(Chlamydomonas)。萊茵衣藻個體呈卵形、球形或橢圓形，前端略尖突，兩側(cè)有兩條等長的鞭毛，可以自由游動。一般球形類的衣藻個體的直徑為5-17mm，卵形類的長為6-27mm，寬為27mm。萊茵衣藻既能光合自養(yǎng)生長，又能依賴乙酸鹽異養(yǎng)生長。生長速度快，細胞數(shù)量倍增時間為5-6小時，可以在短時間內(nèi)獲得大量遺傳后代進行遺傳分析。目前，其基因組序列測序已完成，大大推進了萊茵衣藻作為模式植物用于分子生物學的研究和基因工程的操作。萊茵衣藻的核基因組大小約為100Mb，線狀的線粒體基因組大小為15.7kb，環(huán)狀的葉綠體基因組大小為203.8kb，是目前少數(shù)的細胞核、葉綠體和線粒體三套基因組均能進行遺傳轉(zhuǎn)化的植物。因此，受到國內(nèi)外廣大學者的關注。

以萊茵衣藻作為生物反應器表達外源基因具有以下優(yōu)勢：①萊茵衣藻生長周期短、生長迅速、光和效率高，有“綠色光和酵母”之稱，能解決底物成本高的問題。②作為真核生物，萊茵衣藻可以對真核蛋白質(zhì)進行準確的翻譯后加工修飾，如糖基化修飾等。③萊茵衣藻遺傳背景清晰，已有較完備的基因組數(shù)據(jù)庫可供利用；葉綠體基因組具有原核基因組的特點，使得萊茵衣藻既可表達真核基因，也可表達原核基因。④萊茵衣藻可以通過“光一生物反應器”進行密閉培養(yǎng)，避免了“基因漂流”對環(huán)境安全產(chǎn)生的潛在性危害，且能進行集約化生產(chǎn)，所以是理想的轉(zhuǎn)基因植物受體。

萊茵衣藻作為一種生物反應器，已成功生產(chǎn)多種重組蛋白及抗體，生產(chǎn)的部分產(chǎn)品并已實現(xiàn)了商品化生產(chǎn)（張洪濤,?艾山江·阿不都拉,?徐田枚等.?萊茵衣藻葉綠體生物反應器研究進展.?生物技術通報.?2007;?2:27-31）。目前已有生物可降解性塑料聚-β-羥基丁酸（王潮崗,?胡章立,?胡煒等.?phbB基因在萊茵衣藻中的表達與分子檢測.?科學通報.?2004;?49(15):1519-1522）、綠色熒光蛋白（Wu?JX,?Hu?ZL,?Wang?CG?et?al.?Efficient?expression?of?green?fluorescent?protein?（GFP）mediated?by?a?chimeric?promoter?in?Chlamydomonas?reinhardtii.?Chin.?J.?Oceanol.?Limnol.?2008;?26(3):242-247）等多種外源基因在衣藻細胞核中成功表達。在衣藻葉綠體中也成功表達了人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體TRAIL蛋白(楊宗岐,?李鐵女,?陳鳳等.?人可溶性TRAIL蛋白在衣藻葉綠體中的表達.?科學通報.?2006;12(51):1400-1405)、人白細胞介素4（趙雅坤,?史賢明,?張忠明.?人白細胞介素4在衣藻葉綠體中的高效轉(zhuǎn)化及表達.?華中農(nóng)業(yè)大學學報.?2006;?25（2）：110-116）、丙肝病毒融合抗原基因NS?3-6（張中林,?山松,?陳曦等.?丙肝病毒融合抗原基因NS3-?C?定點整合入衣藻葉綠體基因組的研究,遺傳HEREDITAS?(Beijing).?1999;?21?(6):1-6）等多種藥用蛋白。

然而，利用衣藻生產(chǎn)得到的重組蛋白，主要是胞內(nèi)表達的蛋白，需要對細胞進行破碎后再純化，繁瑣的純化操作程序，不僅降低重組蛋白的回收率，還使蛋白的構(gòu)象容易發(fā)生改變。即便是在目的蛋白加上序列標簽，通過各種親和層析手段進行純化，除了具有以上的缺點外，還需要去除序列標簽，這對目的蛋白的分離純化以及應用生產(chǎn)帶來極大的不便。

此外，體外基因表達系統(tǒng)進行外源基因表達，在進行轉(zhuǎn)基因生物的檢測時，一般會通過宿主細胞是否賦有新的抗性而進行篩選。因此，這種抗性基因?qū)胨拗骷毎螅瑫a(chǎn)生相應的抗性蛋白。人類在進食轉(zhuǎn)基因食品的同時，就會擔心這些抗性蛋白對人類的健康會產(chǎn)生不利的影響。利用信號肽構(gòu)建分泌型表達載體進行外源基因的表達，則可以將目的蛋白分泌到細胞外，利于目的蛋白的分離純化，不需要擔心因食用轉(zhuǎn)基因抗性蛋白而對身體產(chǎn)生影響。但目前國內(nèi)市面上未有萊茵衣藻分泌型表達載體出售，同時未見有萊茵衣藻分泌表達外源基因的構(gòu)建方法及應用。

因此，現(xiàn)有技術還有待于改進和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供萊茵衣藻分泌型表達載體及分泌型表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術中存在的問題。

本發(fā)明的技術方案如下：