[發明專利]萊茵衣藻分泌型表達載體及分泌型表達系統的構建方法

有效

• 申請號: 201110070784.1
• 申請日: 2011-03-23
• 公開（公告）號: CN102181471A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 胡章立;吳錦霞;陳俊
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12R1/89
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所 44268
• 代理人: 楊宏

1.一種萊茵衣藻分泌型表達載體的構建方法，其特征在于：根據萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信號肽預測軟件進行信號肽預測，人工合成或擴增預測的萊茵衣藻分泌型蛋白的信號肽基因序列，將信號肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動子序列和克隆位點之間，構建萊茵衣藻分泌型表達載體。

2.根據權利要求1所述的萊茵衣藻分泌型表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、以萊茵衣藻分泌型蛋白信號肽序列為來源，合成上游含有Nhe?I限制性酶切位點的信號肽基因序列；

S2、將步驟S1中合成的信號肽基因序列克隆到商用載體pUC57中，插入位點為Sma?I，得到含有信號肽基因序列的載體；

S3、使用限制性內切酶EcoR?I消化質粒pSP124，將獲得的表達盒RBCS2∷ble∷RBCS2與經EcoR?I消化的pH105載體連接，通過Kpn?I酶切篩選正向連接的質粒，獲得的質粒命名為pH124；

S4、使用限制性內切酶Nhe?I消化含有信號肽基因序列的載體，回收，再用Sma?I酶切位點消化，切膠回收含有信號肽基因序列的片段，插入經Nhe?I和Pmac?I消化的載體pH124，獲得萊茵衣藻分泌型表達載體載體。

3.根據權利要求2所述的萊茵衣藻分泌型表達載體的構建方法，其特征在于，步驟S1中所述萊茵衣藻分泌型蛋白的信號肽是PHOX蛋白的信號肽或Fe-assimilating?protein?2的信號肽或VAMP72-family的R-SNARE?protein的信號肽。

4.一種萊茵衣藻分泌型表達載體，其特征在于，含有以萊茵衣藻分泌型蛋白的信號肽來源合成的信號肽基因序列，信號肽基因序列位于構建的載體中啟動子序列和多克隆位點之間。

5.根據權利要求4所述的萊茵衣藻分泌型表達載體，其特征在于，所述萊茵衣藻分泌型蛋白的信號肽是PHOX蛋白的信號肽或Fe-assimilating?protein?2的信號肽或VAMP72-family的R-SNARE?protein的信號肽。

6.一種萊茵衣藻分泌表達外源基因系統的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、萊茵衣藻分泌型表達載體的構建：根據萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信號肽預測軟件進行信號肽預測，然后人工合成或擴增預測得到的信號肽基因序列，將信號肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動子序列和克隆位點之間，構建萊茵衣藻分泌型表達載體;

S2、轉基因受體藻株的選擇與培養；

S3、外源基因分泌型表達載體的構建：將外源基因插入所述萊茵衣藻分泌型載體中，構建含有外源基因的外源基因分泌型表達載體；

S4、外源基因分泌型表達載體的遺傳轉化；

S5、分泌型轉基因衣藻的篩選。

7.根據權利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達外源基因系統的構建方法，其特征在于，步驟S1中所述的萊茵衣藻分泌型蛋白的信號肽是PHOX蛋白的信號肽或Fe-assimilating?protein?2的信號肽或VAMP72-family的R-SNARE?protein的信號肽。

8.根據權利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達外源基因系統的構建方法，其特征在于，步驟S2中所述的轉基因受體藻株為萊茵衣藻的不同品系。

9.根據權利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達外源基因系統的構建方法，其特征在于，步驟S4中所述的遺傳轉化是采用珠磨法、基因槍法或電轉化法。

10.根據權利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達外源基因系統的構建方法，其特征在于，步驟S5中所述的分泌型轉基因衣藻的篩選包括以下步驟：通過抗性平板篩選或者營養缺陷型篩選，對經過初步篩選獲得的轉基因衣藻進行分子檢測，確定能分泌表達外源基因。