[發(fā)明專利]一種基于EGFP的T載體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110070698.0
• 申請日: 2011-03-23
• 公開（公告）號: CN102409061A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設計）人: 何華綱;朱姍穎;吳春篤
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

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技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，特別涉及一種T載體及其制備方法。

背景技術

PCR是分子生物學和基因工程領域中最基本的技術之一，它是在體外獲得大量目的基因或DNA片段的有效手段。PCR過程是由具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶介導催化。當使用高保真DNA聚合酶擴增時，可得到具有平末端的PCR產物，而使用普通的TaqDNA聚合酶擴增時，可得到3’末端都具有單個凸起的A的PCR產物。這是因為普通的TaqDNA聚合酶除了正常的合成功能之外，還具有不依賴于DNA模板的合成能力，能夠在PCR產物的3’末端額外地添加一個脫氧核苷酸，通常為dATP，使PCR產物并不是具有平末端的雙鏈DNA，而是兩個3’末端都多了一個A的雙鏈DNA。正是這類PCR產物所具有的凸起的A，為PCR產物的直接克隆提供了便利，即可使用T-A克隆的方法，對PCR產物不作限制性內切酶處理的情況下，就可以在DNA連接酶的作用下，直接將PCR產物連接到T載體上。

在進行T-A克隆時，比較關鍵的是制備T載體，即在兩個3’末端都具有一個凸起的T的線性化載體。T載體是處理構建好的前T載體而得到的，通常有兩種策略：一種是利用能產生平末端的限制性內切酶（如EcoR?V、Sma?I）切割前T載體，得到具有平末端的線性化載體，然后在普通TaqDNA聚合酶的催化下，將dTTP添加到線性化載體的3’末端；另一種是利用特殊的限制性內切酶（如Xcm?I、Eam1105?I）切割前T載體，直接產生兩個3’末端都具有一個凸起的T的線性化載體。與第一種方法相比，使用第二種方法制備T載體時更加簡便。

在構建前T載體時，不同的開發(fā)者往往使用不同的篩選標記基因，已商品化的T載體上的篩選標記基因主要是b-半乳糖苷酶a肽段基因（lacZ’）、細胞死亡控制基因（ccdB）等。使用lacZ’基因作為篩選標記基因時，可以根據(jù)a-互補原理，利用藍白斑實現(xiàn)陽性克隆的篩選，但需要使用lacZ’缺陷型大腸桿菌菌株，還需要使用價格昂貴的X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基硫代半乳糖苷），另外，這兩種試劑的失效或在平板上涂布不勻，都可能導致顯色失敗，產生假陽性結果。使用ccdB基因作為篩選標記基因時，由于ccdB產物的毒性，不產生載體自連的菌落，極大地提高了T-A克隆的效率，但在構建前T載體時需要使用特殊的菌株。

增強型綠色熒光蛋白基因（EGFP）也可作為篩選標記基因，借助紫外線的激發(fā)甚至日光的照射，可以觀察到綠色熒光，因此，可以直接根據(jù)綠色熒光的有無，簡便地篩選到陽性克隆。但是，由于EGFP基因連接在誘導型強啟動子（如lac啟動子、T7啟動子等）下游，在實現(xiàn)陽性克隆的篩選時，還需使用IPTG作為誘導劑，且綠色熒光不夠強，需在紫外燈下進行篩選，而紫外線的照射可能對菌落或目的基因造成損傷，或者在37℃下進行長時間的培養(yǎng)，通常為16-18小時，在這樣的條件下很容易產生衛(wèi)星菌落。這兩個因素限制了EGFP基因在T-A克隆中的應用。因此，要有效地利用EGFP基因作為篩選標記，最關鍵的是在EGFP基因上游采用組成型強啟動子，無需紫外線照射或長時間培養(yǎng)，在日光或日光燈照射下，就能夠看到菌落是否具有明顯的綠色熒光。大腸桿菌lpp基因啟動子是一個組成型強啟動子，?krlj等人報道了突變的脂蛋白（lpp）基因的啟動子（Pm），它具有更強轉錄活性。本發(fā)明將該突變啟動子構建到EGFP基因上游，成功構建了以EGFP基因作為篩選標記的T載體，應用該T載體進行T-A克隆時，載體自連產生的假陽性菌落在37℃培養(yǎng)12小時后，在日光照射下即可呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，極大地提高了T-A克隆的效率。

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發(fā)明內容

本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術中的不足，提供一種制備T載體的方法，以提高T-A克隆的效率。

本發(fā)明以增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因作為篩選標記，用組成型強啟動子Pm介導EGFP基因的表達，并將能切割前T載體制備T載體的限制性內切酶（EcoR?V、Xcm?I等）識別位點引入EGFP基因上游。

1、一種基于增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的T載體，所述T載體的兩個末端位于組成型啟動子和EGFP基因之間，所述T載體應用于T-A克隆時，載體自連產生的假陽性菌落在日光下呈現(xiàn)綠色熒光，攜有外源DNA的陽性菌落呈現(xiàn)白色；