[發(fā)明專利]一種負(fù)載rhBMP-2殼聚糖微球及其制備方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110069901.2
• 申請(qǐng)日: 2011-03-22
• 公開（公告）號(hào): CN102138905A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉昌勝;錢秀珍;王靖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K9/16
• 分類號(hào): A61K9/16;A61K38/18;A61K47/36;A61P19/08
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;鐘華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蛋白類生物活性因子載體及其制備方法，更具體地涉及一種負(fù)載重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)殼聚糖微球及其制備方法。

背景技術(shù)

隨著基因工程和生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的生物活性因子用于治療和預(yù)防疾病。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone?morphogenetic?protein-2，BMP-2)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員之一，具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化與增殖的能力，在修復(fù)骨缺損和促進(jìn)骨愈合方面起重要作用(Reddi，A.H.，Bone?morphogenetic?proteins：from?basic?science?to?clinical?applications.J?Bone?Joint?Surg?Am，2001，83-A?Suppl?1(Pt?1)：S1-6)。但純的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和其它細(xì)胞生長(zhǎng)因子一樣，容易被酶降解、體內(nèi)半衰期短，在局部和全身應(yīng)用很快被稀釋代謝，生物利用度很低，所以重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的有效發(fā)揮需要合適的載體。

殼聚糖(chitosan)是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，由2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖苷經(jīng)糖苷鍵連接而成，是自然界中唯一的天然堿性多糖，也是少數(shù)具有正電荷的天然產(chǎn)物之一。許多實(shí)驗(yàn)表明殼聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解后的產(chǎn)物在體內(nèi)安全、無(wú)毒副作用。目前，利用殼聚糖制備化療藥物、蛋白和基因等藥物的緩釋、控釋微球已取得較好的效果。為達(dá)到藥物的持續(xù)釋放，通常采用交聯(lián)劑對(duì)殼聚糖微球進(jìn)行交聯(lián)。馮慶玲等(Niu，X.，et?al.，Preparation?and?characterization?of?chitosan?microspheres?for?controlled?release?of?synthetic?oligopeptide?derived?from?BMP-2.J.Microencapsulation，2009.26(4)：297-305)采用乳化—離子交聯(lián)法制備載重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球，將蛋白與殼聚糖的混合溶液滴入含表面活性劑的液體石蠟中，乳化后滴入三聚磷酸鈉溶液進(jìn)行反應(yīng)形成微球，產(chǎn)物采用大量石油醚、異丙醇清洗后冷凍干燥，體外累積釋放7天達(dá)62.3％。黃鑫等將rhBMP與殼聚糖的混合溶液加入含表面活性劑的辛醇溶液中，乳化后采用生物交聯(lián)劑京尼平進(jìn)行交聯(lián)，產(chǎn)物微球采用異丙醇、石油醚、水反復(fù)漂洗，制得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球體外釋放可達(dá)30天。專利CN101637454采用靜電液滴—離子交聯(lián)法制備了人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。在靜電場(chǎng)下，將蛋白和殼聚糖的混合溶液滴入含三聚磷酸鈉的凝膠浴中，形成人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球，體外緩釋周期達(dá)4周以上。但是采用戊二醛、京尼平和三聚磷酸鈉等交聯(lián)劑制備的交聯(lián)殼聚糖微球在體內(nèi)的炎癥反應(yīng)程度較純殼聚糖明顯增加，并且交聯(lián)降低了微球在體內(nèi)降解速率(Mi，F(xiàn).-L.，et?al.，In?vivo?biocompatibility?and?degradability?of?a?novel?injectable-chitosan-based?implant.Biomaterials，2002，23(1)：181-191)。同時(shí)制備過(guò)程中的界面效應(yīng)、電壓、超聲攪拌等因素也易使蛋白失去活性，而且殼聚糖微球整個(gè)制備過(guò)程都要保持無(wú)菌操作，工藝相對(duì)繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容

由于殼聚糖對(duì)蛋白有良好的親和能力，殼聚糖微球可通過(guò)疏水作用、靜電作用和氫鍵相互作用吸附蛋白，條件溫和，操作簡(jiǎn)單，因此本發(fā)明的目的在于提供一種負(fù)載rhBMP-2殼聚糖微球，rhBMP-2吸附在所述殼聚糖微球上，不僅吸附容量高，且rhBMP-2不易失活。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述微球的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述微球的應(yīng)用。

本發(fā)明的負(fù)載rhBMP-2殼聚糖微球，基質(zhì)為殼聚糖微球，負(fù)載的藥物為rhBMP-2，所述rhBMP-2吸附在所述殼聚糖微球上，且rhBMP-2與殼聚糖的重量比為1～30∶100。

根據(jù)本發(fā)明，所述殼聚糖微球的平均粒徑為1～300μm。

根據(jù)本發(fā)明，所述殼聚糖微球由殼聚糖與離子交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)再采用氫氧化鈉溶液處理制得。

本發(fā)明的負(fù)載rhBMP-2殼聚糖微球的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(a)、將殼聚糖溶液分散到含有表面活性劑的油相形成W/O型乳狀體系；

(b)、將離子交聯(lián)劑溶液加入到所述W/O型乳狀體系反應(yīng)1～12小時(shí)，加入丙酮，收集殼聚糖微球；